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減少內源性核糖核酸酶對逆轉錄聚合酶鏈反應的影響

來源:論文匯編 作者:自動采集 2005-1-1
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摘要: 在對人體組織細胞基因表達進行分析時,RNA的迅速降解是重要的影響因素。組織一旦從正常生存環境中分離,其中的RNA合成和降解的相對速率就發生改變,這不僅引起組織細胞中各種RNA相對含量發生變化,也導致整個RNA濃度的降低。組織標本被收集后,現已有一些方法可用于阻止組織中RNA濃度的降低。外源性的核糖核酸酶(RNase)污......



  在對人體組織細胞基因表達進行分析時,RNA的迅速降解是重要的影響因素。組織一旦從正常生存環境中分離,其中的RNA合成和降解的相對速率就發生改變,這不僅引起組織細胞中各種RNA相對含量發生變化,也導致整個RNA濃度的降低。

  組織標本被收集后,現已有一些方法可用于阻止組織中RNA濃度的降低。外源性的核糖核酸酶(RNase)污染,特別是用RNase處理提取DNA時,通常是RNA丟失的一個重要原因。防止這種污染對保護RNA降解是絕對必需的,但對所有的RNA項目分析卻是不夠的。提取RNA時,常用RNase抑制劑如焦碳酸二乙酯(DEPC),或離液劑如氯化胍或異硫氰酸胍。這些抑制劑常結合使用,其對防止RNA降解是有益的,但是費時費力。用中性甲醛緩沖液快速固定組織標本或用乙醇等,破壞RNase活性,不僅增加了RNA分離的復雜性,還可能抑制逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測中的聚合酶的活性。

  為了減少分析RNA的時間和RNA提取、純化導致的分析結果差異,一些學者提出無需RNA提取分離的RT-PCR技術,使RNA降解發生的時間大大縮短。然而許多實驗室還未成功地采用這些方法,以RNA提取為基礎的分析系統仍然是分子醫學檢驗的主流。

  Hamalainen等通過實驗顯示,檢測微小殘留慢性骨髓性白血病分析時,一種潛在的RNase——嗜酸性細胞中的神經毒素是降低RT-PCR敏感性的主要因素。通過用單克隆抗體或密度梯度分離除去嗜酸性細胞,可顯著增加無需RNA分離的RT-PCR的信號。與用細胞裂解或分離RNA的RT-PCR技術檢測費城染色體(bcr/abl易位)方法相比,該法可能更快速、敏感和有更好的重現性。如果這種方法能廣泛應用,它將呈現一種明顯的進步。

  嗜酸性細胞中的神經毒素是RNase A超級家族中的一員,這個家族基因位于人類第14號染色體q24~q31區域,編碼許多密切相關的非分泌型RNase。這些基因各包括兩個外顯子:一個單一內含子將一個非編碼外顯子1與外顯子2的編碼序列分開。這些基因的產物蛋白質有相同的活性位點殘基和幾乎相同的二級結構。嗜酸性細胞中的神經毒素(RNase2)僅在吞噬細胞中表達,包括中性粒細胞、大顆粒的嗜酸性細胞和單核細胞。

  其他一些相似的內源性非分泌型的RNase使得人類組織的分子生物學研究復雜化。RNase1幾乎在所有健康人類組織都有表達。相反,第二種嗜酸性細胞RNase——嗜酸性細胞陽離子蛋白(RNase3)僅存在于嗜酸性細胞。RNase4存在于人類一些體細胞組織,包括肝、胰、肺、骨骼肌、腎臟和胎盤,但不存在于腦中。RNase4或一個抗原相似蛋白,也存在于血清。參與血管生成的RNase——血管生成素,有一相似的組織分布。RNase6位于健康人的單核細胞和中性粒細胞,但嗜酸性細胞中沒有。RNase A超級家族所有成員很可能都來源于單一原始的RNase基因的復制。

  盡管它們二級結構有很高的同源性和相似的氨基酸活性位點,這些RNase的功能卻不同。例如,血管生成素除了血管生成作用,還特異地降解t-RNA,而不降解m-RNA。嗜酸性細胞陽離子蛋白的RNase活性還不到嗜酸性細胞神經毒素RNase活性的1%。因為各種RNase的相對濃度在不同組織中不同,通過化學或物理方法除去單一酶或組織成分的分析對RT-PCR試驗的影響很難估計。

  Hamalainen等的實驗還顯示,通過提取總RNA的RT-PCR,可將bcr/abl易位的檢出率提高理論最小值的4倍,用物理方法除去嗜酸性細胞的RT-PCR試驗與總RNA的RT-PCR相比可提高3倍檢出率,用Ficoll-Hypaque的密度梯度去除則可提高約2倍檢出率。當然,即使除去嗜酸性細胞,一些RNase活性的升高仍可能來自存在的RNase1和RNase4~6。

  去除嗜酸性細胞后檢出率的顯著提高,說明分子檢測應注重組織中的細胞和分子成分在實驗中的作用(包括污染作用),盡管該方法不可能去除RT-PCR分析測定中所有的RNase,但一些富含RNase的細胞成分(如嗜酸性細胞)可用物理的方法從待分析的組織細胞中分離。Hamalainen等除了提出技術框架外,實驗中冰凍部分的顯微解剖對一些標本的處理也是有益的。另外,通過分析實驗系統中的測定結果,為優化非特異RNase抑制劑(如DEPC)的濃度提供可能。總之,設計特異的RNase抑制劑(如抗-RNase單克隆抗體),在細胞裂解中或裂解后加入以減少RNase的影響,將比現在應用的非特異抑制劑效果顯著。通過努力減少內源性RNase對RNA分析的影響,在提高敏感性和重復性上,比采用過細的實驗技術以減少外源污染時得到的結果更好。

                                             崔杰峰譯 潘柏申校


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