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人類角膜緣干細胞對外周血淋巴細胞作用的實驗研究

來源:中華現代眼耳鼻喉科雜志 作者:鄧宏偉,姚曉明 2006-8-18
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摘要: 【摘要】 目的 觀察體外培養的人類角膜緣干細胞對同種異體外周血淋巴細胞的作用。方法 通過植片技術分離人角膜上皮細胞以及角膜緣干細胞。在兩種細胞單層上,觀察同種異體外周血淋巴細胞對絲裂原刀豆蛋白A(ConA)的增殖反應。另外,將兩種細胞培養上清直接轉移到由ConA刺激的淋巴細胞增殖系統,以觀察兩種細胞釋放某些......


  【摘要】  目的  觀察體外培養的人類角膜緣干細胞對同種異體外周血淋巴細胞的作用。方法  通過植片技術分離人角膜上皮細胞以及角膜緣干細胞。在兩種細胞單層上,觀察同種異體外周血淋巴細胞對絲裂原刀豆蛋白A(ConA)的增殖反應。另外,將兩種細胞培養上清直接轉移到由ConA刺激的淋巴細胞增殖系統,以觀察兩種細胞釋放某些因子的抑制效應。結果  單層角膜緣干細胞對ConA刺激的外周血淋巴細胞增殖反應可以施加有效的抑制效應。角膜緣干細胞培養上清對ConA刺激的外周血淋巴細胞增殖系統,在72h分離上清顯示有明顯抑制效應。結論  角膜緣干細胞通過細胞交互作用和(或)釋放某些抑制性因子對淋巴細胞的活化和增殖發揮潛在的抑制作用。

  【關鍵詞】  角膜上皮細胞;角膜緣干細胞;細胞培養

  Studies on the keratolimbal stem cell to the pericirculation lymphocyte activation and proliferation

  DENG Hong-wei,YAO Xiao-ming.Shenzhen Eye Hospital,Affiliated Hospital of Jinan University Medical College,Shenzhen 518001,China

  【Abstract】  Objective  To investigate the regulation of host lymphocyte activation by the allograft of limbal stem cells.Methods  Limbal stem cells and the corneal epithelial cells were cultured and isolated from human corneas by explant technique.The mediums of each cells were gathered time and were freeze at different time in -20℃ after purification.Lymphocytes of the other body were cultured in mediums stimulated by Con A.Limbal stem cells or the corneal epithelial cells of the human were co-cultured with the lymphocytes from the other bodys blood.Lymphocyte proliferation assay was assessed by MTT colorimetric determination.Results  Significant proliferation of the lymphocytes was shown after adding the Con A.The gathered supernatant of the 72h either from the limbal stem cells or the corneal epithelial cells was shown a potent inhibitory effect of the lymphocytes proliferation.The monolayer domestic rabbits limbal stem cells,showed a significant suppressive effect on the allograft lymphocytes proliferation after mixed lymphocyte culture for 48h,but this phenomenon couldnt be seen in the monolayer corneal epithelium in vitro.Conclusion  The results show that there would be a lot of possible mechanisms that worked independently or worked in concert to inhibit the lymphocytes proliferation,but mainly by cell-cell interaction and/or some other soluble factors,and limbal stem cells would take a role on raising the eye immunity.

  【Key words】  corneal epithelium; limbal stem cell; cell culture

     在比較聯合角膜緣的穿透性角膜移植與單純大植片角膜移植的術后植片存活率的比較時發現,前者的排斥反應發生率低[1,2],其機制尚未見研究報道,是否因為角膜緣干細胞有抑制淋巴細胞生長的功能,亦尚無此方面研究報道,我們前期的實驗證實兔角膜緣干細胞可通過細胞交互作用和(或)釋放某些抑制性因子抑制同種異體兔淋巴細胞的活化和增殖[3]。本實驗旨在觀察人類同種異體角膜緣干細胞對宿主淋巴細胞活化和增殖的調節效應,并進一步從實驗室體外培養角度證實角膜緣干細胞與角膜上皮細胞相比在引起同種異體排斥反應中的作用。

  1  材料與方法

  1.1  人角膜緣干細胞的培養及條件培養基的制備  在無菌條件下取新鮮人角膜,將角膜分為中央和角膜緣組織,去除角膜內皮細胞以及后2/3角膜板層后,將組織切成1mm×2mm,上皮細胞面向下置于12孔培養板中,每孔有3塊組織。加入少量完全細胞培養基(RPMI-1640培養基,10%胎牛血清,1ml雙抗),切勿使組織塊漂浮。在37℃體積分數為5%CO2和95%空氣條件下進行培養,培養基每1天更換1次,6天去除接種組織塊。當細胞形成單層達70%以上時,用0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA液(1∶2)消化傳代。在12孔板選擇生長良好匯合的傳代細胞。在12h內使用無血清RPMI-1640培養基換液3次以去除殘留的培養基。然后,每孔加入新鮮無血清培養基2ml,繼續培養,每24h收集上清1次,共收集5次。2000r/min離心10min,取上清液,去除細胞碎屑,加入1g/L質量濃度牛血清白蛋白(FBS)。使用3.47μm分子截流量透析袋透析濃縮25倍,-20℃凍存。

  1.2  ConA誘導的同種異體人外周血淋巴細胞的增殖  取同種異體人外周血3ml,先用PBS液等量稀釋,在緩慢加入3ml的淋巴細胞分離液(上海第一生物制品所研制)。20℃密度梯度離心(2000r/min×20min)后,取出分離好的單核細胞層,用PBS沖洗2次后,加入4ml完全培養基,打勻細胞后,計數。調整細胞濃度至5×109個/L,使用96孔培養板,每孔加細胞100μl,并分別加入各個時間段所取的角膜上皮細胞或角膜緣干細胞的條件培養基50μl,各作6個復孔。設立各組的平行對照組,每孔加入ConA(concanavalin A,C2631,Sigma)至終濃度為2.5mg/L。5ml/L CO2,37℃培養48h。用四甲基偶氮唑鹽比色分析法(MTT法)[4]測定所誘導的淋巴細胞轉化:各孔加入MTT(5mg/ml)20μl,繼續培養4h,低溫密度梯度離心(4℃,3000r/min離心10min),小心吸出全部上清,采用MTT法,每孔加入MTT溶解液100μl,微量振蕩器震蕩30min,使MTT還原產物甲月替(for mazan)完全溶解。酶標儀測定540nm光密度值(OD)。

  1.3  混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction,MLR)[5]  分別將人角膜上皮細胞以及角膜緣干細胞(反應細胞)和同種異體人外周血淋巴細胞(刺激細胞),等量細胞濃度(0.5×109個/L)混合。使用96孔板,每孔加反應細胞和刺激細胞各100μl。37℃孵育48h,用MTT比色分析法測定所誘導的淋巴細胞轉化OD值。

  1.4  統計學分析  應用SPSS 10.0醫學統計軟件,將各組所測的OD值進行單因素方差分析,比較組間差異。P<0.05為差異有顯著性,P<0.01為差異有極顯著性。

  2  結果

  2.1  人角膜緣干細胞對絲裂原激活同種異體外周血淋巴細胞的抑制作用  在ConA存在下,人外周血淋巴細胞發生顯著的增殖效應。但將ConA加人外周血淋巴細胞在同種異體角膜緣干細胞及角膜上皮細胞培養的不同時間段的條件培養基中共育時,72h收集的不論是角膜緣干細胞或是角膜上皮細胞的條件培養基均對外周血淋巴細胞的增殖有顯著性抑制作用(P<0.01)(見圖1)。

  2.2  與人角膜緣干細胞共育對同種異體外周血淋巴細胞活性的影響  分別將角膜緣干細胞、角膜上皮細胞與等量的同種異體外周血淋巴細胞共育48h,角膜緣干細胞顯著減弱同種異體人外周血淋巴細胞增殖反應(P<0.01)(見圖2)。

  2.3  角膜上皮細胞對外周血淋巴細胞活性的影響  在角膜上皮細胞存在時,同種異體人外周血淋巴細胞活性未見明顯受抑制,但角膜上皮細胞培養的72h上清對外周血淋巴細胞有顯著抑制效應(見圖1、2)。圖1  淋巴細胞與角膜上皮細胞及角膜緣圖2  角膜緣干細胞以及角膜上皮細胞與淋巴細胞混合培養

  2.4  角膜緣干細胞原代培養  與角膜上皮細胞原代培養相比,角膜緣干細胞增殖能力明顯強于角膜上皮細胞,培養第3天,可見大量正在分裂的細胞(見圖3),培養第7天角膜緣干細胞增生分化出的上皮細胞已呈片狀布滿整個培養孔。圖3  角膜緣干細胞原代培養

  3  討論

  綜合所述,可以得到以下推論:(1)角膜上皮細胞分泌的細胞因子有抑制同種異體外周血淋巴細胞的作用,但是將單層角膜上皮與外周血淋巴細胞共育以上作用就顯著下降;(2)角膜緣干細胞可分泌抑制同種異體外周血淋巴細胞的細胞因子,并且在形成角膜緣干細胞單層后,這種對同種異體外周血淋巴細胞的抑制作用更強;(3)角膜緣干細胞或角膜上皮細胞體外培養,在72h產生相應的細胞因子對抑制外周血淋巴細胞增殖作用最顯著。

  以上推論提示:角膜緣干細胞除了具有在角膜移植術后提供角膜上皮生長源泉從而降低排斥發生的作用外,還可能通過下述2條途徑來實現其抑制免疫排斥反應的作用:(1)釋放可溶性細胞因子;(2)通過細胞膜相關的抑制因子或細胞通訊。已證實在培養狀態下角膜緣干細胞可表達IGF-1(insulin-like growth factor type 1)、TGF-β1、TGF-β2、LIF(leukemia inhibitory factor)、bFGF及其相關受體[6]。目前已研究發現在治療由于干細胞缺乏所致的眼表疾病中,角膜緣干細胞移植術明顯提高了單純行部分穿透角膜移植的手術成功率。這一現象表明了干細胞對維持角膜處于相對免疫赦免狀態起著重要作用[7,8]。但是目前尚未見對角膜緣干細胞免疫原性的研究報道,并已證實角膜緣干細胞具有屏障功能,可顯著阻礙新生血管的長入[9],但是角膜緣干細胞是否具有阻礙外周血淋巴細胞進入的功能尚未得到證實。

  我們的研究表明,角膜緣干細胞可能通過釋放可溶性細胞因子以及細胞間通訊來有效地阻礙同種異體外周血淋巴細胞進入的功能。該作用尚未見其他研究報道證實。角膜緣干細胞移植是否通過阻礙同種異體外周血淋巴細胞進入而提高高危移植的成功率尚需進一步的實驗及臨床研究。

  【參考文獻】

  1  洪榮照,吳護平,王印其,等.角膜緣移植聯合穿透性角膜移植的臨床觀察.眼科,1998,7(4):224.

  2  龔向明,劉紅山,鐘興武,等.角膜緣上皮移植聯合角膜移植治療眼化學燒傷.中國實用眼科雜志,1998,16(8):472.

  3  鄧宏偉,李辰,陳建蘇,等.角膜緣干細胞對外周血淋巴細胞活化和增殖作用的實驗研究.眼科研究,2003,21(3):261-263.

  4  Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunological Methods,1983,65:55.

  5  Coligan JE,Kruisbeek AM,Margululies DH,et al.Current protocols in immunology.New York: Greene Publish in Gand Wiley Inter Science,1991,3-12.

  6  Li DQ,Tseng SCG.Three patterns of cytokine expression potentially involved in epithelial-fibroblast interactions of human ocular surface.J Cell Physiol,1995,163: 61.

  7  Holland EJ,Djalilian AR,Schwartz GS.Management of aniridic keratopathy with keratolimbal allograft: a limbal stem cell transplantation technique.Ophthalmology,2003,110(1):125-130.

  8  Solomon A,Ellies P,Anderson DF,et al.Long-term outcome of keratolimbal allograft with or without penetrating keratoplasty for total limbal stem cell deficiency.Ophthalmology,2002,109(6):1159-1166.

  9  Dua HS,Azuara-Blanco A.Limbal stem cells of the corneal epithelium.Surv of Ophthalmol,2000,44(5): 415.

 *基金項目:2003年深圳市科技計劃項目基金(編號:200404197)

  作者單位: 518001 廣東深圳,暨南大學醫學院附屬深圳眼科中心 深圳市眼科醫院

  (編輯:宋  曉)


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