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CD34、CD59在陣發性睡眠性血紅蛋白尿中的表達及意義

來源:濱州醫學院學報 作者:王學霞 孫建榮 高 娜 于文征 張化道 2011-6-30
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摘要: 【摘要】 目的 研究陣發性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)患者骨髓CD34+細胞比率及外周血粒、紅細胞CD59表達陽性率并探討其臨床意義。方法 采用流式細胞術檢測20例PNH患者骨髓單個核細胞(BMMNC)中CD34+細胞比率及外周血中粒、紅細胞CD59表達陽性率。 結果 PNH患者CD34+細胞比率顯著低于正常人(P0。其中增生減低組CD34+細胞比......


【摘要】  目的 研究陣發性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)患者骨髓CD34+細胞比率及外周血粒、紅細胞CD59表達陽性率并探討其臨床意義。方法 采用流式細胞術檢測20例PNH患者骨髓單個核細胞(BMMNC)中CD34+細胞比率及外周血中粒、紅細胞CD59表達陽性率。 結果 PNH患者CD34+細胞比率顯著低于正常人(P<0.01);其中增生減低組CD34+細胞比率低于增生活躍、增生明顯活躍組(P均<0.05),而后兩組之間差異無顯著性(P>0.05)。正常人外周血粒、紅細胞CD59表達陽性率均>95%,其中粒細胞CD59表達穩定性較好;PNH患者外周血粒、紅細胞CD59表達陽性率與正常對照組相比均顯著減低(P<0.01);粒細胞CD59在不發、偶發、頻發組中表達逐漸減低且差異均有顯著性(P<0.05),紅細胞CD59表達則在三組之間差異無顯著性(P>0.05)。 結論 CD34+造血干細胞減少可能參與PNH發病;外周血粒、紅細胞CD59檢測是診斷PNH的特異性及敏感性方法,其中粒細胞CD59缺失程度對判斷病情嚴重與否具參考價值。

【關鍵詞】  陣發性睡眠性血紅蛋白尿;CD34;CD59;流式細胞術

Expression of CD34 and CD59 in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and their clinical significance

  WANG Xuexia SUN Jianrong GAO Na YU Wenzheng ZHANG Huadao

  Department of Hematology,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603

  【Abstract】 Objective To study the bone marrow CD34+ cell ratio and positive expression of CD59 on granulocytes and erythrocytes from peripheral blood in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(PNH) and to explore their clinical significance.Methods

  The ratio of CD34+ cell in bone marrow mononuclear cells(BMMNC) and expression of CD59 on peripheral granulocytes and erythrocytes in 20 patients with PNH were detected by flow cytometry along with labelled CD34 and CD59 monoclonal antibodies.Results The ratio of CD34+ cell in PNH patients was significantly lower than that in control group (P<0.01). There was a significant difference between hypocellular PNH and normo/hypercellular PNH(P<0.05),but no difference was found between the two latter groups(P>0.05). The positive expression ratio of CD59 on peripheral granulocytes and erythrocytes in control group were all more than 95% and the former had a better stability.The expression of CD59 on both granulocytes and erythrocytes in PNH patients remarkably decreased as compared with that in control group (P<0.01 ).There was a significant difference of the expression of CD59 on peripheral granulocytes among the frequent,occasional and no hemoglobinuria group(P<0.05) while there was no significant difference of the expression of CD59 on erythrocytes among the three groups (P>0.05).Conclusion The reduction of CD34+ hematopoietic stem cells may be involved in the pathogenesis of PNH. Detection of CD59 on granulocytes and erythrocytes from peripheral blood could be considered as a specific and sensitive method for the diagnosis of PNH. The deficiency of CD59 on granulocytes is related to the severity of disease.

  【Key words】 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,CD34,CD59,flow cytometry

  陣發性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)是一種后天獲得性造血干細胞PIGA基因缺陷導致糖化磷脂酰肌醇(GPI)合成障礙而引起GPI錨蛋白缺失的慢性溶血性疾患,臨床主要表現為補體介導血管內溶血、全血細胞減少、靜脈血栓形成傾向三大特征。為了進一步揭示PNH疾病本質,探討其特異性診斷指標和理想治療靶點,我們利用流式細胞術對PNH患者骨髓單個核細胞(BMMNC)CD34及外周血粒、紅細胞CD59 的表達進行了檢測,現將研究結果報告如下。

  1 資料與方法

  1.1 研究對象 PNH患者20例均系2007年1月—2008年12月我院血液內科門診及住院患者;其中男11例,女9例;年齡23~67歲,中位年齡41歲;按血紅蛋白尿發作分為頻發組8例、偶發組7例、不發組5例;按骨髓增生程度分為增生減低組6例、增生活躍組9例、增生明顯活躍組5例;所有病例均符合文獻診斷標準[1]。骨髓正常對照組8例系胸外科非血液疾患行手術切除肋骨者;外周血正常對照組10例系健康體檢者。

  1.2 實驗方法

  1.2.1 主要試劑與設備:貝克曼庫爾特流式細胞儀FC500、IgG單克隆抗體FITC、CD34單克隆抗體FITC、Optilys溶血素為美國貝克曼庫爾特公司產品,CD59單克隆抗體PE、IgG單克隆抗體PE、紅細胞裂解液FACS為BD公司產品。

  1.2.2 標本采集及處理:常規穿刺抽取髓液2 ml于EDTA抗凝管中混勻,采用淋巴細胞分離液分離BMMNC,調整細胞數為1×107/ml備用;采集晨起空腹靜脈血2 ml,EDTA抗凝。

  1.2.3 BMMNC表面CD34表達:PBS洗滌BMMNC 1次,細胞沉淀加溶血劑及透膜劑各500 μl并輕輕混勻,室溫避光作用10 min,PBS洗滌1次,去上清,細胞沉淀用PBS調制成細胞濃度為106/ml的單細胞懸液。分別取100 μl BMMNC懸液加入兩個試管中,對照管中加20 μl IgG單抗FITC,試驗管中加20 μl CD34 單抗,輕輕振蕩混勻,室溫避光放置15 min,2 h內采用FCM分析。

  1.2.4 外周血粒細胞表面CD59表達:分設實驗管和對照管,每管加入約含106/ml個粒細胞的抗凝全血100 μl。對照管加入20 μl IgG單克隆抗體PE、10 μl IgG單克隆抗體PC5,實驗管加入20 μl CD59單克隆抗體PE、10 μl CD45單克隆抗體PC5;混勻,室溫避光孵育30 min。加入2 ml紅細胞裂解液,靜置10 min,1000 r·min-1離心10 min,PBS洗滌2次,棄上清,加入PBS 1 ml懸浮細胞,30 min內上機檢測。

  1.2.5 外周血紅細胞表面CD59表達:將EDTA抗凝全血采用密度梯度離心法取得紅細胞并加入PBS制成106/ml紅細胞懸液;分設實驗管和對照管,每管加入紅細胞懸液100 μl。對照管加入20 μl IgG單克隆抗體PE,實驗管加入20 μl CD59單克隆抗體PE;混勻,室溫避光孵育30 min,PBS洗滌2次,棄上清,加入PBS 1 ml懸浮細胞,30 min內上機檢測。

  1.3 統計學處理 采用SPSS統計軟件包進行數據處理與分析,數據以x±s表示,采用方差分析和多組間兩兩比較q檢驗

  2 結果

  2.1 PNH各組、正常對照組BMMNC中CD34+細胞比率,見表1。表1 PNH患者和正常人BMMNC中CD34+細胞比率組別

  經方差分析,PNH各組BMMNC中CD34+細胞比率與正常對照組相比顯著降低(P均<0.01);其中增生減低組CD34+細胞比率顯著低于增生活躍、增生明顯活躍組(P均<0.05),而后兩組之間比較差異無顯著性(P>0.05)。

  2.2 PNH各組、正常對照組外周血粒、紅細胞CD59表達率見表2。表2 PNH患者和正常人外周血粒、紅細胞CD59表達率組別

  10例正常人外周血粒細胞和紅細胞CD59表達陽性率均>95%,其中粒細胞CD59表達穩定性較好,紅細胞CD59表達個體差異稍大。經方差分析,PNH患者粒、紅細胞CD59表達陽性率(均<90%)與正常對照組相比顯著減低(P均<0.001)。將PNH患者按病情分為不發組、偶發組、頻發組,粒細胞CD59在不發、偶發、頻發組中表達陽性率逐漸降低,三組之間兩兩比較差異均有顯著性(P均<0.05);紅細胞CD59在不發、偶發、頻發組中表達陽性率雖依次有所降低,但三組之間兩兩比較差異無顯著性(P均>0.05)。

  3 討論

  目前研究[2]認為,PNH系由于起源于造血干細胞水平的X染色體PIGA基因突變(Xp22.1)導致GPI合成障礙而引起血細胞表面GPI錨蛋白缺失的獲得性溶血性疾患;其亦屬于造血干細胞疾患范疇,但一顯著特征是體內正常造血克隆與異常PNH克隆同時并存。PNH造血干細胞生物學特性與常人有何不同、異常克隆何以長期生存并逐漸擴增、如何準確檢測異常克隆并早期診斷PNH一直是臨床關注與研究的熱點。

  造血干細胞(HSC)的免疫表型特征為CD34+、Ckit+、CD38-、HLADR-、Lin-、CD45RA-、CD7-,其中最重要的是CD34分子。CD34分子是一種分子量為1.15×105的I型跨膜蛋白分子,其并非造血干細胞所特有,可從干細胞開始連續表達直至造血前體細胞,但表達量隨細胞分化程度的提高而逐漸減低。近年來,隨著單抗技術的逐步推廣和FCM的廣泛應用,直接檢測骨髓CD34+細胞已成為一種簡單、快速、準確鑒定HSC的方法并逐漸用于臨床常規檢查。

  本研究表明,PNH患者CD34+細胞比率明顯低于正常對照組,且其減低程度與骨髓增生程度具相關性,骨髓增生減低的PNH患者CD34+細胞比率減低尤為顯著;說明PNH雖因干細胞PIGA基因突變導致異常克隆產生,但相對于正常人其CD34+造血干細胞在數量上仍遠遠不足,亦即提示PNH異常克隆本身可能并不具備內在增殖優勢,而是在骨髓正常造血功能衰竭的基礎上才取得相對生長優勢而得以維持與擴增。肖娟等[3]亦發現PNH患者骨髓CD34+造血干/祖細胞比正常人少,而且其中CD59細胞明顯多于CD59+細胞,提示PNH患者正常造血干/祖細胞數量減少、異常造血干/祖細胞在數量上占有相對優勢;Keller等[4]則通過PIGA基因突變的小鼠模型研究證實,單獨PIGA基因突變并非PNH克隆獲得增殖優勢而導致PNH發病的唯一原因。目前趨向認同,PNH的出現是機體在骨髓衰竭背景下發生基因突變,導致血細胞表面GPI錨蛋白缺失,從而使缺陷細胞逃避免疫系統T細胞的殺傷而得以生存下來并進一步擴增,即機體以溶血為代價而避免了更為嚴重的骨髓衰竭[5];此為PNH發病的雙重打擊學說,亦從側面闡釋了為何PNH與骨髓造血衰竭性疾患再生障礙性貧血(AA)關系密切且可相互轉化與共存。

  PNH發病過程中GPI錨蛋白尤以補體調節蛋白CD55(衰變加速因子,DAF)和CD59(反應性溶血膜抑制物,MRIL)最為重要;前者可加速補體C3轉化酶的衰變從而抑制補體的激活,后者則可通過與補體C9結合而抑制膜攻擊復合物的形成;因CD55、CD59存在于所有血細胞表面且與補體溶血關系密切,故而將兩者缺失作為PNH克隆的標記[2]。近年來,應用流式細胞術和單克隆抗體技術直接檢測血細胞表面GPI錨蛋白CD55、CD59的缺失已成為臨床診斷PNH的新型方法,當CD55-或CD59-細胞占3%~5%時即可檢出,此與傳統的酸化血清溶血試驗(Ham試驗)相比敏感性更高、特異性更強;其中CD59的檢測尤為可靠[6]。

  本組研究發現,10例正常人外周血粒、紅細胞CD59表達陽性率均>95%,其中尤以粒細胞CD59表達穩定性為好。20例PNH患者粒、紅細胞CD59表達陽性率與正常對照相比均顯著降低;其中粒細胞CD59在不發、偶發、頻發組中表達漸次減低,三組之間比較差異有顯著性;紅細胞CD59表達則三組之間無顯著差異;提示外周血粒、紅細胞CD59缺失對PNH診斷具較高特異性及敏感性,其中粒細胞CD59缺失程度對判斷病情嚴重與否具參考價值。此與黎緯明等[7]報道基本一致。研究表明[8],在PNH克隆發展過程中,首先累及的是粒細胞,其數量受輸血、溶血因素影響較小且CD59粒細胞多可被最早檢出且百分率最高,因而粒細胞CD59檢測對PNH早期診斷具重要價值。盡管如此,臨床實際工作中仍有不少PNH病例單用流式細胞儀CD59檢測不易確診。Brodsky等[9]發現嗜水氣單胞菌屬細菌產生的毒素aerolysin可通過與GPI蛋白連接在細胞膜上形成通道而導致正常細胞溶破,PNH細胞則由于缺乏GPI蛋白使其具抵抗毒素作用而最終保持細胞完好;將在此基礎上加以技術改進制成的Alexa488標記前aerolysin變異體(Flaer)聯合CD59來檢測PNH克隆,可大大提高診斷的敏感性與特異性,在日后臨床應用上具廣闊前景。

【參考文獻】
   [1] 張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].第2版.北京:北京科學出版社,1998:3338.

  [2] Rosti V. The molecular basis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J].Haemotology,2000,85(1):8287.

  [3] 肖娟,武永吉,張之南,等. 陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥患者骨髓CD34+CD59+細胞與CD34+CD59-細胞生物學性能的研究[J].中華血液學雜志,2003,24(4):169173.

  [4] Keller P,Payne JL,Tremml G,et al.FESCre targets phosphatidylinositol glycan class A (PIGA) inactivation to hematopoietic stem cells in the bone marrow[J].J Exp Med,2001,194(5):581589.

  [5] Karadimitris A, Manavalan JS, Thaler HT,et al.Abnormal Tcell repertoire is consistent with immune process underlying the pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J].Blood, 2000,96:26132620.

  [6] Pilar MH,Marta MA,Julia A,et al.Comparative analysis of different flow cytometry based immunophenotypic methods for the analysis of CD55 and CD59 expression on major peripheral blood cell subsets[J].Cytometry,2002,50(3):191201.

  [7] 黎緯明,李菁媛,鄒萍,等.干細胞缺陷性疾病患者兩種GPI錨蛋白表達及臨床意義[J].中國臨床醫學,2007,14(4):606608.

  [8] Hillmen P. Implications of recent insights into the pathophysiology of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J].Br J Haemaol,2000,74(1):4252.

  [9] Brodsky RA,Mukhina GL,Nelson KL,et al.Resistance of cells to the glycosylphosphatidlinositolbinding toxin aerolysin[J].Blood,1999,93(5):17491756.

 


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