當前位置:首頁 > 醫源資料庫 > 在線期刊 > 濱州醫學院學報 > 2009年第32卷第5期 > 曲格列酮誘導胃癌SGC7901細胞凋亡的研究

曲格列酮誘導胃癌SGC7901細胞凋亡的研究

來源:濱州醫學院學報 作者:于媛 王娟 楊建 謝書陽 焦飛 2011-6-30
336*280 ads

摘要: 【摘要】 目的 觀察過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPAR γ)的配體曲格列酮(troglitazone,TGZ)對胃癌SGC7901細胞凋亡的影響。方法 體外培養人胃癌SGC7901細胞,SGC7901細胞分為對照組和曲格列酮不同濃度(5、10、15、20 μmol/L)加藥組,應用流式細胞儀檢測曲格列酮不同濃度對胃癌SGC7901細胞凋亡率的影響。結......


【摘要】  目的 觀察過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPAR γ)的配體曲格列酮(troglitazone,TGZ)對胃癌SGC7901細胞凋亡的影響。方法 體外培養人胃癌SGC7901細胞,SGC7901細胞分為對照組和曲格列酮不同濃度(5、10、15、20 μmol/L)加藥組,應用流式細胞儀檢測曲格列酮不同濃度對胃癌SGC7901細胞凋亡率的影響;RTPCR及Western blot方法觀察PPARγ、p53的mRNA及蛋白表達變化。結果 曲格列酮可誘導胃癌SGC7901細胞凋亡,凋亡率與濃度呈正相關;曲格列酮干預后,p53的mRNA及蛋白在胃癌SGC7901細胞中表達上調,而PPARγ的mRNA及蛋白表達水平無明顯改變。結論 曲格列酮依賴激活PPARγ能在體外誘導胃癌細胞凋亡,其機制可能是通過上調抑癌基因p53表達而實現,提示PPARγ可能是胃癌治療的一個新分子靶點。

【關鍵詞】  曲格列酮;過氧化物酶體增殖激活受體γ;p53;胃癌;凋亡

Effects of troglitazone on induction of apoptosis in human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901

  YU Yuan1 WANG Juan2 YANG Jian3 XIE Shuyang1 JIAO Fei1

  1 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Binzhou Medical University,Yantai 264003

  2 Department of Cell Engineering,Binzhou Medical University;3 Central Blood Station of Yantai

  【Abstract】 Objective To investigate the effect of peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) ligand troglitazone (TGZ) on induction of apoptosis in human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901.Methods Human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901 was cultured in vitro. SGC7901 cell line was divided into control group and treatment groups with different concentrations of TGZ (5,10,15,20 μmol/L).The changes of apoptosis at each concentration in the SGC7901 were detected by flow cytometry method. The mRNA and protein expression of PPARγ and p53 were investigated by RTPCR and Western blot respectively.Results The effect of troglitazone on the induction of apoptosis in SGC7901 cells was significant with flow cytometry detection. Furthermore, the rate of apoptosis in SGC7901 cells treated with troglitazone at various concentrations showed a dosedependent manner. After treated with troglitazone,the mRNA and protein expression of p53 was upregulated. However, the expression of PPARγ has no significant changes.Conclusion These results indicate that the apoptosis effect of troglitazone is mediated through PPARγ signaling pathway in gastric adenocarcinoma cell in vitro.The mechanism is probably associated with upregulating of the anticancer gene p53.It's suggested that PPARγ might be a novel therapeutic target for gastric adenocarcinoma.

  【Key words】 troglitazone,peroxisome proliferator activated receptor gamma,p53,gastric adenocarcinoma,apoptosis

  腫瘤的發生是一個多因素、多步驟的復雜過程,涉及一系列遺傳學改變,包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。胃癌是我國最常見的消化道腫瘤,其發生、發展亦涉及多個基因的相互作用,如RAS基因家族、MYC基因家族、p53、RB等[1,2]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)屬于核激素受體超家族中的成員,是一類由配體激活的核轉錄因子。近年來許多研究表明PPARγ及其配體在人類多種腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡中具有調節作用[3],曲格列酮(TGZ)是其合成配體中藥效最強的一種藥物,且其毒副作用相對較小[4]。p53是人類腫瘤中最常見的突變基因。p53基因的突變或失活與多種腫瘤的發生、發展密切相關,幾乎在所有惡性腫瘤中都存在P53蛋白表達上調的現象[5]。為了探討人類胃癌細胞中PPARγ經其特異性配體激活后,能否促進胃癌細胞凋亡及其可能涉及機制,本實驗利用人胃癌SGC7901細胞進行體外研究,以期尋找一條新的胃癌治療途徑。

  1 材料與方法

  1.1 材料

  1.1.1 藥品與試劑:細胞培養基RPMI 1640購自美國GIBCO公司,胎牛血清為杭州四季青公司生產。曲格列酮為生物晶美公司產品。藥物實驗前TGZ溶解于二甲基亞砜(DMSO)中,用無血清培養基稀釋至200 μmol/L原液,-20℃凍存,使用時用細胞培養液稀釋至終濃度。TRIZOL試劑購自Invitrogen公司,RTPCR試劑盒購自大連寶生物公司,流式細胞試劑購自Beckman公司,PPARγ及p53小鼠抗人單克隆抗體購自生物晶美公司。

  1.1.2 細胞培養:人胃癌SGC7901細胞株購自于中科院上海細胞庫,培養基為含10%胎牛血清的RPMI 1640(100 U/ml青霉素、100 μg/ml慶大霉素),在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。

  1.1.3 實驗分組:將SGC7901對數生長期細胞懸液調整為4×105/ml接種,培養24 h后,隨機分為5組:對照組(細胞+培養液)和加藥組(5、10、15、20 μmol/L組)。對照組和加藥組均按48 h培養。

  1.2 方法

  1.2.1 流式細胞儀檢測凋亡率:收集培養48 h后的對照組和加藥組細胞,用75%冰乙醇固定,調整細胞濃度為5×107/ml,分別取100 μl的細胞懸液于流式管中,每管加入4.5 μl AnnexinFITC冰上放置避光10 min,再加入2.5 μl PI,避光反應5 min,在488 nm波長處進行檢測,記錄激發波長493nm處的紅色熒光,上流式細胞儀(EpicsXLⅡ型Beckman Coulter)進行檢測。

  按TRIZOL試劑說明書提取細胞中的總RNA,測定RNA的濃度及純度。取總RNA 2 μl,按RT試劑盒說明進行逆轉錄,隨后取RT產物1 μl進行PCR擴增。PPARγ、p53及內參βactin引物序列及產物長度參見表1。PCR反應條件為:25 μl體系95℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30個循環;最后72℃充分延伸10 min。表1 RTPCR引物序列及產物長度

  1.2.4 Western blot檢測PPARγ、p53的蛋白表達變化:將對數生長期的SGC7901細胞消化,吹打成單細胞懸液,計數,調整細胞終濃度為2×108/L,置于100 ml培養瓶中,每瓶10 ml,待細胞貼壁生長后,棄上清,按照上述實驗分組,加藥作用48 h后收集細胞,提取總蛋白,蛋白定量后進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE),轉膜后加入含小鼠抗人PPARγ、p53單克隆抗體(1∶500稀釋)的一抗封閉液,置搖床上30 min,4℃過夜,次日漂洗封閉后加入同位素標記兔抗鼠IgG(1∶2 000稀釋)的封閉液,置搖床上晃動2 h后漂洗,經放射自顯影后觀察蛋白表達的改變。

  1.2.5 統計學處理:應用SPSS11.0軟件進行統計處理,數據用x±s表示,采用方差分析和Dunnett檢驗進行比較,P<0.05為差異具有統計學意義。

  2 結果

  2.1 流式細胞儀檢測曲格列酮對SGC7901細胞凋亡的影響 SGC7901細胞經5、10、15、20 μmol/L曲格列酮作用后,隨著劑量的增加,與對照相比,凋亡細胞逐漸增加,凋亡率分別為9.3%、12.3%、21.5%和23.7%,與對照相比差異均有顯著性(P<0.05,圖1及表2)。表2 TGZ對SGC7901細胞凋亡的影響組別 凋亡率# 與5 μmoI/L TGZ組比較差異有統計學意義(P<0.05)

  2.2 RTPCR 檢測曲格列酮對SGC7901細胞PPARγ及p53基因mRNA表達的影響 曲格列酮誘導SGC7901細胞凋亡時PPARγ及p53基因mRNA變化經RTPCR檢測顯示,SGC7901細胞中PPARγ的mRNA表達與曲格列酮的作用濃度無關,而p53的mRNA表達隨著曲格列酮作用濃度的增加而升高(圖2)。

  2.3 Western blot檢測曲格列酮對SGC7901細胞PPARγ及p53基因蛋白表達的影響 曲格列酮誘導SGC7901細胞凋亡時PPARγ及p53基因蛋白變化經Western blot檢測顯示,SGC7901細胞中PPARγ的蛋白表達與曲格列酮的作用濃度無關,而p53的蛋白水平隨著曲格列酮作用濃度的增加而升高(圖3)。

  3 討論

  胃癌是我國最常見的消化系腫瘤,其發病機制尚未闡明。由于胃癌在早期即可發生轉移,對放療敏感性差,生存率低,因此不斷探索高效、高選擇性、低毒性的治療方法仍具有重要意義[6]。為了探討TGZ對胃癌細胞的作用機制,我們以體外培養SGC7901細胞為研究對象,觀察了不同濃度的TGZ對誘導SGC7901細胞凋亡的作用,并檢測了細胞凋亡前后抑癌基因p53表達的變化,旨在探討PPARγ激動劑TGZ誘導SGC7901細胞凋亡的機制,為TGZ輔助治療胃癌提供實驗依據。

  過氧化物酶體增殖激活受體是一類由配體激活的核轉錄因子,屬于Ⅱ型核受體超家族。迄今為止,共發現了三種PPAR,即PPARα、PPARβ和PPARγ,其中PPARγ及其激動劑是目前研究最多、最廣泛的受體[7]。TGZ是一種人工合成的PPARγ激動劑,含有一個噻唑烷二酮環的化學基團,能夠和PPAR緊密結合并激活PPAR,隨后被激活的PPAR通過打開或關閉特定的基因來調控基因的表達。大量資料證明,PPARγ激動劑對多種腫瘤具有明顯的體外抗腫瘤作用[8,9]。PPARγ生物學功能復雜,近年來研究顯示,PPARγ在多種腫瘤組織中均有表達,且其被特異性配體激活后,可誘導腫瘤細胞分化,抑制包括結腸癌、胃癌、肺癌、食管癌等惡性腫瘤細胞的增殖或誘導腫瘤細胞凋亡[10,11]。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程,也是清除非機體所需細胞、維持自身細胞數穩定的一種特殊的細胞死亡方式,而細胞凋亡機制異常在腫瘤的發病中具有重要作用[12]。

  本實驗觀察發現,不同濃度曲格列酮干預SGC7901細胞后能明顯誘導其凋亡,與正常對照組相比,各組間差異有統計學意義,而且凋亡的誘導程度呈現劑量依賴趨勢。大量研究證實,p53可通過多種機制促進細胞凋亡,主要涉及下調抗凋亡蛋白的表達而上調促凋亡蛋白的表達兩種途徑[13]。本文中不同濃度曲格列酮可逐漸上調p53基因mRNA和蛋白的表達,這提示曲格列酮干預后能誘導SGC7901細胞凋亡可能與其調節細胞內p53的表達水平有關,而凋亡過程中下游信號分子的改變尚有待進一步研究。另外,本文結果顯示,PPARγ的表達水平在處理前后并無明顯變化,這提示PPARγ除了可以在含量方面進行調節外,還可以在其它層面進行調節[14]。例如,有研究顯示PPARγ的活性及細胞內定位可以影響其作用的發揮[15]。

  總之,本實驗表明TGZ作為PPARγ的高親和力配體,可能通過上調p53表達誘導凋亡,進而抑制胃癌細胞的生長。PPARγ激動劑的抗腫瘤效應可能為未來胃癌治療提供一個新途徑。這一初步結論還需要體內實驗進行驗證,并從基因和蛋白水平對其具體機制進行深入探討。

  (下轉第334頁)


醫學百科App—醫學基礎知識學習工具


頁:
返回頂部】【打印本文】【放入收藏夾】【收藏到新浪】【發布評論



察看關于《曲格列酮誘導胃癌SGC7901細胞凋亡的研究》的討論


關閉

網站地圖 | RSS訂閱 | 圖文 | 版權說明 | 友情鏈接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 醫源世界 版權所有
醫源世界所刊載之內容一般僅用于教育目的。您從醫源世界獲取的信息不得直接用于診斷、治療疾病或應對您的健康問題。如果您懷疑自己有健康問題,請直接咨詢您的保健醫生。醫源世界、作者、編輯都將不負任何責任和義務。
本站內容來源于網絡,轉載僅為傳播信息促進醫藥行業發展,如果我們的行為侵犯了您的權益,請及時與我們聯系我們將在收到通知后妥善處理該部分內容
聯系Email: