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大鼠肝癌發生過程中Caspase3的表達及意義

來源:濱州醫學院學報 作者:寧巍巍 劉同慎 李笑巖 王 東 白咸勇 2011-6-30
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摘要: 【摘要】 目的 探討Caspase3在肝癌發生發展中的作用和意義。方法 應用免疫組織化學SP法,對二乙基亞硝胺(DEN)誘發大鼠肝癌發生過程中Caspase3的表達進行了系統觀察。結果 ①DEN誘發大鼠肝癌發生率為100%。②在正常大鼠肝臟、誘癌早期(1~8周)及誘癌中期(9~16周)可見少量肝細胞及枯否細胞呈Caspase3陽性表達,......


【摘要】  目的 探討Caspase3在肝癌發生發展中的作用和意義。方法 應用免疫組織化學SP法,對二乙基亞硝胺(DEN)誘發大鼠肝癌發生過程中Caspase3的表達進行了系統觀察。結果 ①DEN誘發大鼠肝癌發生率為100%;②在正常大鼠肝臟、誘癌早期(1~8周)及誘癌中期(9~16周)可見少量肝細胞及枯否細胞呈Caspase3陽性表達,隨著肝癌發生進程,Caspase3陽性枯否細胞數量增多,在癌結節中可見Caspase3陽性肝細胞,并且結節周邊部比中央部陽性細胞多。結論 本研究表明肝細胞Caspase3的低表達和枯否細胞Caspase3的高表達可能與肝癌的發生和發展有關。

【關鍵詞】  Caspase3;肝癌發生;免疫組織化學;大鼠

The expression and singnificance of caspase3 during hepatocarcinogenesis in rats

  NING Weiwei LIU Tongshen LI Xiaoyan WANG Dong BAI Xianyong

  Department of Histology and Embryology , Binzhou Medical University,Yantai 264003

  【Abstract】 Objective To investigate the expression of Caspase3 during hepatocarcinogenesis induced by diethylnitrosamine(DEN) in rats systematically.Methods The expression of Caspase3 was measured by immunohistochemical SP method. Results ①The incidence of hepatocarcinoma induced by DEN was 100%.②The expression of Caspase3 was detected occasionally in hepatocytes and Kupffer cells of normal rats and hepatoma rats with DEN treatment for 116 weeks.With the progress of hepatocarcinogenesis ,the number of kupffer cells expressing Caspase3 increased progressively,and the number of hepatocyes expressing Caspase3 in periphery of hyperplastic nodule was more than that in the centre.Conclusion The results suggest that the low expression of Caspase3 in hepatocytes and the high expression of Caspase3 are related closely to the development and progression of hepatoma.

  【Key words】 Caspase3,hepatocarcinogenesis,immunohistochemistry,rat

  Caspases即富含半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白酶,是一與細胞凋亡相關的蛋白酶家族,它可激活細胞內的DNA酶,切割染色體DNA,直接導致細胞凋亡。Caspase3是Caspase家族中最重要的凋亡執行者,作為細胞凋亡效應分子,參與細胞的生理及病理性死亡過程,是細胞凋亡研究的中心分子,腫瘤發生、發展的重要原因是細胞增殖與凋亡的動態平衡失調所致[1]。有研究報道Caspase3在許多正常人體組織和腫瘤組織中表達,但在肝癌發生過程中導致細胞凋亡功能低下的機制尚不明確[2]。本研究采用免疫組織化學方法檢測了大鼠肝癌發生過程中Caspase3 的表達,旨在探討Caspase3 在肝癌發生、發展中的作用和意義。

  1 材料與方法

  1.1 肝癌動物模型的建立和病理學檢查 將150只雄性Wistar大鼠隨機分為模型組(135只)和對照組(15只)。模型組飼以含二乙基亞硝胺(DEN,0.08‰)飲水,連續12周后改為自由飲水;對照組常規自由飲水。于實驗第4、8、12、16、18、20、22、24、25周,隨機選擇模型組動物10~15只斷頭處死,大體觀察和記錄肝臟的形態、顏色、質地變化后,取肝組織,4%多聚甲醛緩沖液固定,常規石蠟包埋,進行3 μm連續切片,HE染色,光鏡觀察。

  1.2 Caspase3免疫組織化學染色 兔抗大鼠Caspase3多克隆抗體購自北京博奧森公司,正常羊血清、兔二步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司,DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。采用SP法,主要步驟:3 μm組織切片常規脫蠟至水, 3%過氧化氫甲醇處理30 min滅活內源性過氧化物酶,檸檬酸緩沖液微波修復10 min,正常羊血清封閉30 min減少非特異性染色,滴加一抗4℃過夜,滴加二抗孵育30 min,DAB顯色,沖洗,脫水,透明,封片。

  2 結果

  2.1 誘癌過程中大鼠肝臟的病理學變化 誘癌早期(1~8周)肉眼觀未見明顯異常。鏡下肝細胞腫脹,部分肝細胞呈嗜酸性變。肝小葉結構尚完整,小葉內可見灶性壞死伴炎性細胞浸潤。誘癌中期(9~16周)肝臟表面出現彌散分布的灰白色結節。鏡下嗜酸性或透明細胞增生灶,并逐漸形成肝細胞增生結節,結節內細胞異型性較小。誘癌晚期(17~25周)肝臟表面布滿大小不一的灰白色結節,切面可見出血和壞死。鏡檢為肝細胞肝癌,呈梁索狀或團塊狀向周圍組織浸潤,癌周組織細胞水腫、嗜酸性變,并有肝細胞增生。

  2.2 誘癌過程中Caspase3的表達 在正常大鼠肝臟、誘癌早期及誘癌中期偶見少量肝細胞及枯否細胞呈陽性表達(圖1、2,箭頭示枯否細胞),隨著肝癌發生進程, Caspase3陽性枯否細胞數量增多,在癌結節中可見Caspase3陽性肝細胞,并且結節周邊部Caspase3陽性肝細胞較中央部多,胞質內可見棕褐色陽性反應顆粒(圖3、4,箭頭示枯否細胞)。

  3 討論

  Caspase家族是一大類凋亡調節基因,是哺乳動物細胞凋亡的啟動者和執行者。根據Caspase在蛋白酶級聯切割反應中的作用位置,分為在上游調控其它Caspase活化的始動Caspase (Caspase1、2、4、5、8、9、10 )和在下游直接介導凋亡實施的效應Caspase(Caspase3、6、7、14) ,其中Caspase3處于核心位置,發揮非常重要的作用,被稱為死亡蛋白酶,它的活性受到抑制,就會引起細胞凋亡障礙,并有可能進一步引起腫瘤的發生和發展。有學者采用臨床原發性肝細胞肝癌患者的病理標本,用免疫組化法檢測Caspase3的表達進行研究發現,Caspase3在正常肝組織、肝硬化、癌旁肝組織及肝癌(HCC)組織中陽性率分別為87.5%、84%、85%及60.4%,Caspase3在肝癌組織中表達明顯低于癌旁組織[1],提示Caspase3的生物活性在肝癌細胞中受到抑制,導致肝癌細胞凋亡難以產生;并且發現Caspase3與HCC的分化程度明顯相關,分化程度越低其表達越弱,提示Caspase3失表達在HCC發生發展過程中發揮重要作用[4]。另外,還有研究采用原位雜交法檢測Caspase3在HCC中的表達發現39例HCC中的53.8 % (21例)不同程度地表達Caspase3,而46.2%的HCC未見Caspase3表達,HCC中Caspase3陽性率低于癌旁非癌肝組織中的陽性率,其表達與腫瘤的分化有關,中等至高分化的HCC中陽性率(72.2% )明顯高于低分化HCC中的陽性率( 31.8% ),而與腫瘤的大小、分級無關[5]。這些研究大部分都是對臨床原發性肝細胞肝癌患者的病理標本進行觀測,而本實驗采用免疫組織化學方法對DEN誘導的大鼠肝癌發生發展過程中Caspase3的表達的動態變化進行了觀察。實驗結果顯示, 在正常大鼠肝臟、誘癌早期及誘癌中期可見少量肝細胞及枯否細胞呈陽性表達,隨著肝癌發生進程, 在癌結節中可見Caspase3陽性肝細胞,并且結節周邊部比中央部陽性細胞多,胞質內有棕褐色陽性反應顆粒。本結果提示,在新陳代謝比較旺盛的肝臟中,肝細胞和枯否細胞均可表達Caspase3。正常情況下,胞質中Caspase3以無活性的Caspase3酶原形式存在,只有當細胞發生凋亡時,才會變為有活性的Caspase3。

  Caspase3處于凋亡途徑的核心環節,在細胞受到刺激、損傷或接到死亡指令等信號時一旦被激活,即可啟動凋亡。枯否細胞屬于單核巨噬細胞系統,位于肝血竇,是體內定居于組織內的巨噬細胞中最大的細胞群體,是機體細胞免疫的重要組成部分,具有多種重要的生理功能,包括對細菌和病原體的吞噬作用,抗原處理及遞呈功能,活化其他的效應細胞,對體內的腫瘤細胞尤其是肝癌細胞具有監視、抑制和殺傷作用[6]。本研究發現在誘癌晚期Caspase3陽性枯否細胞數量增多,這表明枯否細胞凋亡活躍,這可能是由于DEN的持續作用使枯否細胞受到損傷所致,枯否細胞凋亡的增加和癌變細胞的快速增殖,使枯否細胞與癌變細胞的比值下降,使得枯否細胞攻擊突變細胞或腫瘤細胞、非特異性清除變性壞死肝細胞以及對腸道來的有毒物質的解毒能力均有所下降,從而進一步促進了肝癌的發生和發展。同時本實驗結果提示,癌變肝細胞Caspase3表達水平低下,表明其凋亡功能低下,以導致其無限增殖、生長擴散。

  近年基礎研究發現,抗癌藥物的療效不僅取決于快速抑制腫瘤生長,亦取決于緩慢誘導腫瘤細胞凋亡[7]。鑒于目前肝癌化療效果普遍不佳, 根據Caspase3 在肝癌細胞凋亡過程中可能存在的作用,我們認為可以考慮設計以Caspase3 為靶標的肝癌治療方案, 以降低肝癌化療的耐藥性, 提高治療效果。

【參考文獻】
   [1] 王維利,孟剛.Caspase3與Survivin在肝細胞肝癌中的表達[J].安徽醫科大學學報,2006,41(3):278280.

  [2] Howard Y,Chang HY,Yang X.Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases[J].Microbiol Mol Biol Rev,2000,64(6):821846.

  [3] 謝晶日,梁國英,李明等.益氣活血化淤法對大鼠肝癌過程中Caspase3及組織學影響的研究[J].中醫藥信息,2009,26(1):6869.

  [4] 彭福森,謝文彪.Caspase3與肝癌細胞凋亡[J].社區醫學雜志,2007,5(2):5456.

  [5] 張羽萍,華靜.枯否細胞在非酒精性脂肪性肝病中的作用[J].國際消化病雜志,2008,28(4):315317.

  [6] 裴志東,楊致遠,薛琪.低劑量PF方案持續注射治療晚期肝癌的療效觀察[J].腫瘤基礎與臨床,2008,21(6):487489.


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