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抑制消減雜交技術篩選肺炎鏈球菌多耐藥相關DNA片段

來源:成都醫學院學報 作者:李燕1,宋瑱1,冷平1,熊輝2,何洋1作者單位:(1.成都 2013-2-27
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摘要: 【摘要】 目的 篩選肺炎鏈球菌多耐藥相關DNA片段,探索肺炎鏈球菌多耐藥的分子機制。方法 提取多耐藥菌株09062407與標準菌株ATCC49619基因組DNA, 應用抑制性消減雜交技術得到富含差異DNA片段的消減混合物,與pEASYT3克隆載體連接并轉化到TP10感受態細胞中,構建多耐藥肺炎鏈球菌差異DNA消減文庫。結果 耐藥株與敏......


【摘要】  目的 篩選肺炎鏈球菌多耐藥相關DNA片段,探索肺炎鏈球菌多耐藥的分子機制。方法 提取多耐藥菌株09062407與標準菌株ATCC49619基因組DNA, 應用抑制性消減雜交技術得到富含差異DNA片段的消減混合物,與pEASYT3克隆載體連接并轉化到TP10感受態細胞中,構建多耐藥肺炎鏈球菌差異DNA消減文庫。結果 耐藥株與敏感株間差異片段大量富集,得到大小200~1 500 bp彌散狀DNA條帶;將這些差異DNA片段富集后構建成消減文庫,隨機挑取192個白色克隆,經PCR擴增,155個克隆插入有200~800 bp大小片段。結論 抑制消減雜交技術能有效篩選肺炎鏈球菌多耐藥株與敏感株間差異DNA片段,可進一步通過克隆鑒定等生物信息學方法尋找與肺炎鏈球菌多耐藥相關基因。

【關鍵詞】  抑制消減雜交;DNA 文庫;肺炎鏈球菌;多耐藥

【Abstract】 Objective To screen multidrug resistance(MDR)associated DNA fragments for providing insight into the molecular mechanism of multidrug resistant streptococcus pneumonia. Methods The genomic DNAs were purified from MDR 09062407 and ATCC 49619. The mixture of subtracted DNA fragments were obtained using suppression subtractive hybridization (SSH) and were ligated with pEASYT3 vector and transformed to competent cells TP10. Then the differential subtraction library was constructed. Results The fragments from 200 to 1500 bp were enriched in streptococcus pneumonia MDR,155 positive clones included 192 randomly selected clones were screened out inserted DNA sequence by PCR. The length of the inserted fragments was from 200 to 800 bp. Conclusions SSH technique can efficiently identify differential DNA fragments between MDR and susceptible strain in streptococcus pneumonia. Many bioinformatics methods will be used to analyze and find genes associated with MDR.

  【Key words】 Suppression subtractive hybridization;DNA library;Streptococcus pneumonia;Multidrug resistance

  近年來,肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae,S.pn)對常用抗菌藥物的耐藥情況日趨嚴重,特別是對青霉素類、大環內酯類、四環素類、復方磺胺甲惡唑以及氯霉素等3種以上抗菌藥物耐藥的多耐藥菌株(MDR)的出現,使肺炎鏈球菌所致重癥感染的治療成為難題。篩選肺炎鏈球菌多耐藥相關DNA進行分析,有助于肺炎鏈球菌多耐藥的分子機制研究,以及新的抗多耐藥菌株藥物靶點的設計。抑制消減雜交技術(suppression subtractive hybridization,SSH)是一種消減雜交與PCR結合的簡單、快速分離差異基因的新技術[1]。經過不斷改進和完善,已成為目前分離新基因的主要方法,是篩選耐藥相關基因的有效手段。本研究以臨床分離的肺炎鏈球菌多耐藥菌株和抗生素敏感的標準菌株為研究對象,通過抑制消減雜交技術獲得與多耐藥相關的DNA片段,為進一步研究肺炎鏈球菌多耐藥分子機制打下基礎。

  1 材料和方法

  1.1 材料

  肺炎鏈球菌多耐藥菌株09062407分離自四川大學華西醫院,KB法藥敏試驗結果顯示對四環素、阿奇霉素、氯霉素、克林霉素、復方磺胺甲惡唑均耐藥。肺炎鏈球菌標準菌株ATCC49619由四川大學華西醫院微生物實驗室保存并提供,為上述抗菌藥物敏感株。聚合酶鏈反應(PCR)選擇性細菌基因組消減試劑盒購自Clontech公司,RsaⅠ酶購自MBI Fermentas公司,pEASYT3克隆試劑盒購自全氏金公司,BM 2000分子量標準、2×PCR Master Mix、柱式DNA回收試劑盒、柱式質粒DNA提取試劑盒、TP10感受態細胞購自博邁德公司,PCR擴增儀為Thermo公司產品,冷凍離心機為Beckman公司產品,電泳儀及凝膠成像系統為BioRad公司產品。

  1.2 方法

  基因組DNA提取及RasⅠ酶切。采用改進的十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法[2]提取細菌基因組DNA。分別將多耐藥菌株09062407 和ATCC49619基因組DNA用RsaⅠ酶切,酚/氯仿抽提,無水乙醇沉淀,調整DNA濃度為300 ng/μl備用,酶切效果良好方可進行后續實驗。抑制消減雜交采用PCR選擇性細菌基因組消減試劑盒,實驗所用接頭及引物見表1。表1 接頭及引物序列

  2 結果

  2.1 RsaⅠ酶切、接頭連接效率分析

  未經RasⅠ酶切的基因組DNA存在5kb彌散帶,酶切后的產物彌散帶在0.1~2.0 kb,酶切效果良好;將酶切產物分別與接頭1、接頭2R連接后,以23SRNA作為檢查接頭連接效率的基因,結果發現連有接頭與未連接頭的23SRNA基因的熒光強度相差不大,兩者熒光強度之比小于4倍,連接效率>25%,符合后續實驗要求。結果見圖1。接頭連接的成功與否是消減雜交成敗的關鍵,如果連接效率<25%,應重新做連接實驗。圖1 接頭的連接效率分析

  2.2 抑制消減雜交結果

  經過兩輪消減雜交后的產物做兩次抑制性PCR,第一次PCR產物少,且彌散,第二次PCR后,差異片段大量富集,電泳結果出現彌散分布帶,大小200~1 500 bp,其中有明顯富集的條帶。結果見圖2。圖2 抑制消減雜交結果

  2.3 消減效率分析

  消減效率分析以23SRNA管家基因在抑制性消減雜交產物中的豐度為參考,結果見圖3。從圖3可以看出,消減后的耐藥株在28次循環后才看到23SRNA產物,說明消減效率良好。圖3 消減效率檢測結果

  2.4 消減文庫構建結果

  第二次PCR產物經純化回收后和pEASYT3克隆得到經藍白斑篩選的消減克隆庫。隨機挑取192個白色克隆應用巢式引物l和巢式引物2R進行PCR后有155個克隆(陽性克隆的比例達80.7%)能擴增出單一片段,大小200~800 bp不等,圖4顯示其中9個克隆進行PCR擴增產生的片段情況。圖4 菌落PCR結果

  3 討論

  國內研究顯示我國肺炎鏈球菌多耐藥情況十分嚴峻,如上海地區2008年細菌耐藥性監測網的監測結果顯示:568株兒童非腦膜炎肺炎鏈球菌中對青霉素不敏感率達21.5%,對紅霉素和克林霉素耐藥率則可達93.1%~97.8%,復方磺胺甲惡唑85.3%[3,4]。目前已知肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥機制主要是通過細菌青霉素結合蛋白基因突變,從而改變細胞壁上高分子量青霉素結合蛋白(PBP)結構, 減少其對抗生素分子的親和力而產生;對大環內脂林可酰胺鏈陽菌素類(MLS)藥物的耐藥機制主要是erm基因介導的核糖體甲基化修飾,可明顯降低細菌與MLS類的結合能力以及主動泵出基因mef介導的主動外排作用;對喹諾酮類藥物的耐藥機制主要是由于2種拓撲異構酶DNA轉旋酶和 DNA拓撲異構酶Ⅳ活性位點的共同改變[5,6]。但是否存在多耐藥相關基因及其他耐藥機制有待進一步研究。比較耐藥株與敏感株之間的基因組差異,無疑對鑒定那些只在耐藥株中存在的可能與耐藥相關的基因區域有很大幫助,可以對肺炎鏈球菌耐藥機制的深入研究開辟一條新途徑。

  抑制消減雜交技術是由Diatchenko建立的一種消減雜交與PCR結合的簡單、快速分離差異基因的新技術。其運用雜交動力學原理,即豐度高的單鏈DNA在退火時產生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA,從而使不同豐度的單鏈DNA得到均衡;抑制PCR則利用鏈內退火優于鏈間退火的優點,使非目的基因片段兩端反向重復序列在退火時產生類似發卡的互補結構,無法作為模板與引物配對,選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增,從而使目的基因得到富集、分離,在一次抑制消減雜交反應中,可同時分離成百的差異基因,實現兩個基因群之間的完整對比。因而,抑制消減雜交具有高特異性、高靈敏度、高效率等優點。經過Akopyants等[7]對抑制消減雜交技術的改良,用于細菌基因組比較分析,為病原體中未知基因的篩選和微生物基因組差異、分子進化的研究提供了重要的技術手段。目前,抑制消減雜交已用于細菌致病基因分離與鑒定[8]、細菌毒力差異及細菌種屬進化關系的研究[9,10]等。

  本次實驗中以臨床分離的多耐藥菌株基因組DNA為被檢方,標準菌株ATCC 49619 基因組DNA為驅動方,通過抑制消減雜交,剔除了相同基因片段,而使耐藥株與敏感株間差異片段大量富集,電泳結果出現彌散狀分布DNA條帶,大小200~1 500 bp,這些差異強化帶可能包含有被檢菌獨有而參考菌缺如的片段,即與多耐藥相關的DNA片段。將這些DNA片段富集后通過與pEASYT3載體連接得到消減文庫,隨機挑取192個克隆經PCR擴增后有155個克隆能擴增出單一的DNA片段,大小200~800 bp不等,提示這些陽性克隆可能插入了高特異性的目的片段,可進一步通過克隆雜交、測序、基因結構分析、蛋白質位點及序列預測等生物信息學方法探尋肺炎鏈球菌多耐藥相關基因及機制。

【參考文獻】
   [1] Diatchenko L, Lau YFC, Campbell AP,et al. Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially regulated or tissuespecific cDNA probe and libaries[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93(5):60256030.

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  [7] Akopyants NS, Fradkov A,Diatchenko L,et al.PCR based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helicobacter pylori[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(10): 1310813113.

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