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出生后不同發育時期大鼠基底前腦雌激素β表達的免疫組織化學研究

來源:成都醫學院學報 作者:張吉強1,蔡文琴1,蘇炳銀2作者單位:(1.第三軍醫大學神 2013-2-27
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摘要: 【摘要】 目的 研究雌激素β受體(estrogen receptor,ERβ)在出生后不同發育時期大鼠基底前腦內表達的變化。結果 在兩性大鼠,出生之日(P0)時均未見ERβ蛋白表達,P3后開始出現散在的陽性細胞。隨后在兩性大鼠基底前腦ERβ的表達增加,在P14~1月齡達到高峰,然后略有下降,但仍保持較高水平,一直到12月齡。到老年時......


【摘要】  目的 研究雌激素β受體(estrogen receptor,ERβ)在出生后不同發育時期大鼠基底前腦內表達的變化。方法 硫酸鎳銨增強顯色的免疫組織化學技術。結果 在兩性大鼠,出生之日(P0)時均未見ERβ蛋白表達,P3后開始出現散在的陽性細胞。隨后在兩性大鼠基底前腦ERβ的表達增加,在P14~1月齡達到高峰,然后略有下降,但仍保持較高水平,一直到12月齡。到老年時,表達明顯減弱,甚至消失。雄性的ERβ免疫反應性強于雌性。陽性物質主要位于細胞核,但在大鼠基底前腦也可見到陽性物質位于細胞漿的情況。結論 ERβ的上述表達模式與性別差異提示該受體可能參與了對基底前腦膽堿能神經元發育和功能的性別差異性調節。ERβ免疫陽性產物也可位于細胞核以外的部位,提示它可能在發育的特定時期還具有非基因型調節效應,即通過第二信使途徑調節膽堿能神經元的結構與功能。

【關鍵詞】  雌激素受體;基底前腦;性別差異

 【Abstract】 Objective To investigate the expression and sex differences of estrogen receptor beta(ERβ)in the basal forebrain of male and female rats.Methods Nickelintensified immunohistochemistry.Results In P0 rats no ERβ immunoreactivities were detected,it appeared from P3 then increase until P30,after that it decreased but remained high levels until 12 months old,while in the old basal forebrain ERβ immunoreactivities decreased significantly.Similar profile was also detected in the females but with less stronger ERβ immunopositive reactivity.The immunopositive materials were predominantly detected in the cell nuclei but also in cytoplasm.Conclusion The above mentioned profile of ERβ in the basal forebrain of both male and female rats indicating its potentiate role in the regulation of cholinergic neurons with sexdifference.Furthermore,this nuclear receptor may also function with nongenomic regulatory pathway besides its classic genomic regulation.

  【Key words】 Estrogen receptor;Basal forebrain;Sex difference

  雌激素在腦內具有多方面的作用,是由其受體(estrogen receptor,ER)介導的。目前已經發現了多種ER,即“經典的”α受體(ERα)和β受體(ERβ)以及雌激素膜性受體(G protein coupled estrogen receptor,GPER)[13]。腦內ERβ對學習記憶、應激等具有重要的調節作用,ERβ表達見于與學習記憶有關的腦區如基底前腦、大腦皮質和海馬[4]。我們先前研究了ERβ成年大鼠腦內表達的性別差異,認為該受體可能是介導雌激素調節學習記憶的功能性受體[5]。近年基因敲除實驗證實了ERβ在學習記憶過程中發揮了重要作用[6,7],然而其機制尚不清楚,因此對腦內ERβ的表達與功能研究具有重要的理論和臨床意義。

  基底前腦包括隔內側核(medial septal nucleus,MS)、斜角帶垂直部背側部(vertical band of Diagonal band,dorsal part;VBDD)和垂直部(vertical band of Diagonal band,ventral part;VBDV)、斜角帶水平部(horizontal band of Diagonal band;HBD)以及嗅結節島(Calleja island,IC)等部位,其纖維投射到大腦皮質與海馬等部位。研究發現基底前腦含有大量的膽堿能神經元,這些神經元參與了學習記憶和阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)等神經退行性疾病的發病過程[8]。我們先前的研究發現成年大鼠基底前腦內ERβ的表達相當高并報道了小鼠基底前腦內ERβ的發育學表達以及循環雌激素對其表達的影響[9,10],但其在大鼠出生后不同時期基底前腦內的發育學表達變化以及性別差異并不清楚。為此,我們應用免疫組織化學技術研究了ERβ在大鼠出生后不同發育時期基底前腦的表達與性別差異,以期為研究雌激素作用于基底前腦神經元的基礎研究提供更多的資料。

  1 材料和方法

  1.1 實驗動物

  SPF級雌雄Wistar大鼠購自本校實驗動物中心。出生之日為P0,以此類推。取P0、P3、P7、P14、1月齡、3月齡、12月齡、18月齡動物,每組3只;成年動物經陰道涂片證實為動情間期。除出生后早期動物經麻醉后直接斷頭取腦外行浸泡固定外,其余均經灌注固定。

  1.2 主要試劑和藥品

  兔抗ERβ多克隆抗體(sc8974)購自Santa Cruz公司;生物素化羊抗兔抗體(ZB2010)與辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素復合物(ZB2404)、封閉血清、DAB等購自北京中杉公司;其余試劑均為市售分析純。

  1.3 動物固定、取材

  5%水合氯醛麻醉后開胸,經左心室插管到主動脈,剪開右心耳,先后灌注生理鹽水200 ml和4%多聚甲醛溶液300 ml,灌注后取出前腦組織(至下丘腦為界),用4%多聚甲醛后固定過夜,然后換30%蔗糖溶液脫水至組織塊沉底。腦組織經OCT包埋后進行連續冰凍切片(片厚30 μm),每隔6片收集一片于含4%多聚甲醛溶液的6孔培養板內備用。

  硫酸鎳銨增強顯色的免疫組織化學SP法參照文獻[5,9,10]進行。切片經磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次后用3%過氧化氫溶液孵育15 min,然后用PBS漂洗3次,切片入5%正常羊血清孵育30 min,傾去血清后切片與兔抗ERβ抗體(1:200)于4℃孵育24 h。PBS漂洗后用二抗(1:200)于室溫孵育1 h,PBS漂洗后用辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素復合物(1∶200)室溫孵育1 h。PBS漂洗后用硫酸鎳銨DAB顯色法室溫顯色5 min后用PBS終止顯色,裱片后于60℃烘烤過夜然后用二甲苯透明、DPX封片。陰性對照操作同前,但用PBS代替一抗。

  1.4 數據統計

  腦核團的定位于顯微鏡下結合Paxinos等的The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates(2007,第六版)進行,用奧林巴斯DX60顯微攝像系統采集數碼圖像。各核團內ERβ免疫反應的強弱根據每只大鼠同一腦區3~5張切片、5只大鼠共計15~25張切片的染色水平綜合判斷,以++++、+++、++、+和表示,分別代表最強、強、中等、低和無明顯表達。

  2 結果

  與一般的DAB/H2O2顯色結果(棕黃色)不同,采用硫酸鎳銨增強的免疫組織化學顯色結果為藍黑色沉淀。結果發現ERβ免疫陽性產物主要位于細胞核,但在特定時期也可在細胞漿甚至突起中檢測到。由于嗅結節島內ERβ蛋白的表達較低,因此我們主要觀察了MS、VBD和HBD內ERβ蛋白的表達情況。P0:此時兩性大鼠基底前腦內未見ERβ蛋白表達。P3:雄性在VBDD有少數的陽性細胞核散在分布(圖1A),雌性仍未見表達。P7:雄性HBD出現陽性細胞,同時MS內也出現少數的陽性細胞(圖1B)。雌性的VBD背側有較多的陽性細胞,MS只有散在的陽性細胞核。P14:雄性的HBD、VBD腹側可見很強的表達(圖1C),VBD背側和MS內的表達較弱。雌性的HBD表達最強(圖1D),其次為VBD背側部。MS和VBD腹側表達較微弱。大部分的陽性細胞可見深染的細胞核與淺染的突起,個別細胞為細胞核陰性而細胞漿與突起著色。雄性的表達明顯強于雌性。1月齡:基底前腦各部位均有ERβ蛋白表達。在雄性,VBD背側部的表達最強,其次為腹側部、MS和HBD(圖1E),為單純的細胞核陽性。在雌性大鼠,MS表達最強,其次為HBD、VBD,細胞核著色深,呈清晰的點狀。3月齡:在雄性,VBD腹側表達最高,MS次之,HBD和VBD背側部較弱。在雌性大鼠,仍然是MS內表達最高,HBD、VBDV次之(圖1F)。陽性物質均位于細胞核。12月齡:陽性信號明顯較3月齡時減弱。雄性主要見于VBD,其中背側部強于腹側部;隔內側核內陽性細胞減少,HBD內更少。雌性則以VBD表達最強,MS次之,HBD內只有少數散在的陽性細胞。18月齡:免疫陽性信號進一步減弱。雄性僅僅在MS內有一些陽性細胞(圖1G),其余部位基本消失。雌性為MS強于VBD,陽性細胞數量多,但信號強度明顯減弱。其余部位基本上未見陽性反應。以上結果總結見表1.表1 生后不同發育時期大鼠基底前腦內的ERβ免疫反應性圖1 硫酸鎳銨增強顯色的免疫組織化學SP法研究ERβ在出生后不同發育時期大鼠基底前腦內的表達

  3 討論

  應用硫酸鎳銨增強顯色的免疫組織化學SP法,我們首次觀察了ERβ蛋白在大鼠基底前腦的發育學表達,實驗結果表明基底前腦內ERβ的表達具有明顯的性別差異,即出生后早期和老年時雄性強于雌性。其次,從發育學表達圖譜來看,新生時基底前腦ERβ蛋白表達較低甚至缺如,隨后逐漸增強,出生后第14天~3月齡時達到高峰,然后逐漸下降,老年(18月齡)時表達顯著降低,在某些部位甚至消失,尤其在雌性更明顯。以上結果與我們對小鼠基底前腦ERβ表達的性別差異研究[9]基本一致,提示ERβ對基底前腦神經元的發育、分化和性別差異可能具有重要的調節作用。

  哺乳動物腦在結構、功能和行為等多方面都存在性別差異,如與生殖功能有關的內側視前區(medial preoptic area,POA)的體積是雄性顯著大于雌性[11]、AD的發病是女性多于男性而PD和老年性耳聾等則是男性多于女性[12]等,造成這些差異的分子機制尚不清楚。研究發現,無論是外周來源的雌激素還是腦局部合成的雌激素都對腦的性分化(包括神經發育、神經元遷移或存活)具有很重要的作用,尤其是在發育階段。如在新生時向雄性小鼠POA注射芳香化酶(雌激素合成酶)抑制劑或芳香化酶反義寡核苷酸,成年后雄性小鼠POA的體積則顯著減小;若向雌性小鼠POA注射芳香化酶激動劑,成年后雌性小鼠POA的體積則顯著增加。

  ERβ在腦內具有多方面的重要功能,尤其是學習記憶等高級功能。Liu等[6]采用藥理學、形態學、分子生物學、生物化學與行為學等方法,證明雌激素對海馬突觸可塑性和記憶受ERβ的調節。ERβ激動劑能促進突觸可塑性的關鍵蛋白PSD95、突觸囊泡素(synaptophysin)和AMPA受體亞單位GluR1的表達,敲除ERβ基因后上述效應被抑制;海馬腦片實驗表明ERβ激動劑能增強LTP,這也能被ERβ基因敲除所抑制。ERβ活化能誘導海馬神經元形態的改變,如促進樹突分枝、增加樹突棘密度等。Srivastava等[7]發現ERβ活化能增加皮質神經元樹突棘密度并促進PSD95的表達、誘導細胞漿內PSD95遷移到突觸后致密物從而形成腳手架樣結構以錨定GluR1等突觸可塑性蛋白,其分子機制涉及到誘導p21活化的激酶(p21activated kinase,PAK)和細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signalregulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化,提示ERβ的活化與細胞骨架的調節相關,表明ERβ通過PAK/ERK1/2依賴的信號途徑快速調節神經元形態。另外,活化ERβ與降低焦慮有關[13]。在胚胎發育時期,ERβ影響皮質分層與中間神經元的遷移、因此對腦的形態發生極為重要[14]。另外,ERβ的表達在很多腦區如下丘腦、中腦等都有性別差異[16,17]。

  基底前腦在學習記憶中有核心作用。研究發現基底前腦含有大量的膽堿能神經元,已經證實這些神經元參與了學習記憶和AD的發病過程,雌激素通過調節膽堿能神經元內的已酰膽堿而增強認知功能,給予雌激素可以改善膽堿能神經元的功能,如促進膽堿能神經元ChAT的表達。基底前腦膽堿能神經元是海馬、大腦皮質核杏仁復合體主要的膽堿能來源,對認知、注意行為有重要意義,在AD中出現功能障礙。這些神經元具有膽堿能的各種標記物,也有神經生長因子受體、鈣結合蛋白、谷氨酸受體以及雌激素受體(ERα和ERβ)。一些中間神經元則含有m型乙酰膽堿受體(mAChRs)、 NADPH黃遞酶、γ氨基丁酸(GABA)以及一些抑制性神經肽如甘丙肽(galanin,在AD中有過表達)。研究發現AD患者基底前腦谷氨酸受體GluR2與鈣結合蛋白的表達失衡,提示在老化過程中這些分子可能協同性誘導興奮性毒性細胞死亡。 基底皮質系統的ChAT活性與膽堿能神經元數量在AD早期數量比較穩定,而在晚期患者隔海馬區則上調;NGF陽性神經元在發病早期即減少,晚期患者則出現trkA mRNA表達減少但p75(NTR)維持不變,表明在AD的進程中伴有基底前腦神經營養的缺失[8]。

  目前對基底前腦ERβ的研究報道不多。我們曾報道了該部位ERβ蛋白的表達[5,9,10],Milner也報道ERβ見于基底前腦[4],BlurtonJones等[15]發現基底前腦ERβ可位于抑制性神經元,提示ERβ可以調節神經元興奮性。以上研究表明ERβ對基底前腦神經結構與功能的保持具有重要的意義。由于基底前腦是AD的主要受累腦區,AD患者的基底前腦出現老年斑(β淀粉樣蛋白沉積)、神經原纖維纏結和膽堿能神經元丟失等病理改變。目前研究認為,在老化過程中,隨著卵巢功能的喪失,循環雌激素水平下降,導致基底前腦膽堿能神經元功能下降,可能是造成老年性癡呆等神經退行性疾病的重要原因。盡管對雌激素替代治療(estrogen replacement therapy,ERT)在AD中的作用還有爭議,但是大量的研究還是表明ERT可有效地緩解上述癥狀從而改善AD的癡呆癥狀、預防或推遲AD的發生,其機理尚不清楚。我們發現ERβ蛋白表達的上述變化趨勢與循環雌激素水平下降的趨勢基本一致,表明老年后雌激素對基底前腦的作用減弱,其原因可能是由于ERβ蛋白的表達減少所致。由于雌性鼠的減弱較雄性顯著得多,因而上述發現或許可以解釋為何AD患者多為女性的原因,因此深入研究基底前腦內ERβ的功能與性別差異研究具有重要的理論和臨床意義。

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