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以激光共聚焦圖像三維重建技術研究小膠質細胞與神經系統其他類型細胞的關系及相互作用

來源:成都醫學院學報 作者:梁亞杰1,2,李淑蓉1,3,林森1,周紅利1,郭強2,蘇炳銀1﹡ 2013-2-27
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摘要: 【摘要】 目的 觀察小膠質細胞在靜息和活化狀態下與中樞神經系統其他細胞類型的空間位置關系和相互作用。采用免疫熒光染色,激光共聚焦和細胞三維成像技術進行形態學觀察。結果 黑質致密部中腦腦片可見典型的多巴胺神經元形態,小膠質細胞呈典型的靜息狀態。靜息狀態下,小膠質細胞有多級分支,環繞星形膠質細胞的胞體。...


【摘要】  目的 觀察小膠質細胞在靜息和活化狀態下與中樞神經系統其他細胞類型的空間位置關系和相互作用。方法 雄性C57BL/6小鼠,紋狀體內注射秋水仙堿建立神經元損傷模型。采用免疫熒光染色,激光共聚焦和細胞三維成像技術進行形態學觀察。結果 黑質致密部中腦腦片可見典型的多巴胺神經元形態,小膠質細胞呈典型的靜息狀態。靜息狀態下,小膠質細胞有多級分支,環繞星形膠質細胞的胞體;星形膠質細胞呈梭形,突起細長,細胞核較小。結論 小膠質細胞與神經元,髓鞘存在密切接觸,與星形膠質細胞之間存在交互性連接。

【關鍵詞】  膠質細胞;三維重建;激光掃描共焦顯微鏡;中樞神經系統

 【Abstract】 Objective To observe the spatiallocation and interaction of microglia and other cell types in central nervous system under resting and activation conditions.Methods Male C57BL/6 mice were used to set up the neurons damage model by striatum injection with colchicines.The morphological manifestation was detected by immunofluorescent staining,Laser cofocus light microscopy and cellular 3D reconstruction.Results The typical dopaminergic neurons were observed at substantia nigra pars compacta in midbrain brain slices.The microglia showed obvious resting state.The microglia with multistage branch and surrounding soma of astrocyte,meanwhile the astrocyte with spindle shape and small hyperchromatic nuclei were observed under resting conditions.Conclusion The close contact exists in microglia and neurons,myelin,interactive connection was exist in microglia and astrocyte.

  【Key words】 Microglia;3 D reconstruction;Laser scanning confocal microscopy;Central nervous system

  近年來對Alzheimer病(AD)和Parkinson病(PD)等神經系統退行性病變的研究證實,炎癥在疾病的發生和進展中發揮了關鍵作用,在這些疾病中均發現顯著的膠質細胞增生和炎性介質表達,如腫瘤壞死因子(TNF)α,白介素(IL)1β,IL6等;同時,多項臨床試驗表明,非甾體類抗炎藥能顯著降低AD和PD的發病率[1,2]。 神經系統炎癥的一個典型特征即膠質細胞增生,包括小膠質細胞和星形膠質細胞的活化和增生。作為腦內的免疫細胞,小膠質細胞在各種中樞神經系統疾病中的作用越來越得到重視[3]。 小膠質細胞在正常情況下處于靜息狀態,監視周圍環境中的危險信號,對腦內的病理變化非常敏感。在病原體侵入,出現外界物質,神經元損傷等情況下會迅速活化,從多分支狀變為阿米巴樣細胞,發揮吞噬功能,和(或)分泌一系列可溶性因子,包括細胞因子、氧自由基、趨化因子、脂肪酸代謝產物(如前列腺素)等[4]。

  既往文獻報道,在PD患者腦標本中發現黑質部位有小膠質細胞活化[5],其后的研究也在PD患者黑質中發現很多與炎癥相關的因子,包括TNFα,IL1β,iNOS等[6]。起初曾認為小膠質細胞活化僅發生在DA神經元大量死亡后,是一個相對較晚出現的事件,但近年的研究發現,小膠質細胞在神經元損傷中發揮了重要作用,并非僅發生在PD晚期。在PD的實驗動物模型中,MPTP,6OHDA,百草枯(paraquat)等都可以造成DA神經元的特異損傷,損傷初期即會誘發小膠質細胞的顯著活化,并通過其分泌的物質加重神經元損傷;同時發現利用內毒素(LPS)直接活化小膠質細胞也能造成DA神經元死亡。這些研究結果提示小膠質細胞活化對神經元具有很強的損傷作用[4]。我們的研究發現紋狀體和黑質(SNc)內神經元均有神經元死亡,鑒于小膠質細胞在神經系統炎癥及損傷中的重要作用,我們采用免疫熒光共聚焦圖像三維重建觀察黑質紋狀體系統內小膠質細胞與神經元,少突膠質細胞,星形膠質細胞的位置關系及相互作用,現將結果報道如下。

  1 材料和方法

  1.1 實驗動物及建立神經元模型

  雄性C57BL/6小鼠,22~25 g,購于第三軍醫大學野戰外科學研究所動物中心。將小鼠隨機分組進行腦內定位注射。戊巴比妥麻醉小鼠,置于小鼠腦立體定位儀,切開頭皮,以0.3%雙氧水處理頂骨表面組織,暴露前囟(Bregma),以之為標準點,將微量注射器移動到下列位置:中線旁開2 mm,前囟前方0.26 mm,標記針頭在頂骨表面的位置點,以針頭在此點鉆孔,以頭骨表面為起始點,將注射器下降3 mm。秋水仙堿被溶解在生理鹽水中(1 mg/ml),總體積0.5 μl,在2 min內注射到紋狀體,留針5 min。對照側以同樣的坐標和同樣的方法注射生理鹽水。

  1.2 形態學觀察

  藥物注射1周后,以4%PFA經心臟灌注小鼠,取腦進行后固定和脫水。將含有SNc的中腦置于含4%PFA的0.1 mol/L PB(pH 7.4,4℃)后固定2~3 d,而后轉移至4℃30%蔗糖0.1 mol/L PB溶液中,直至標本沉入瓶底。行冰凍切片,取大腦冠狀面,厚度為20 μm,取含有紋狀體和SNC的切片,保存于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中。對免疫熒光,酪氨酸羥化酶(TH),髓鞘堿性蛋白(MBP),cd11b和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)作為一抗。根據不同目的采用針對性的熒光標記二抗,如異硫氰酸熒光素(FITC)或Cy3標記的抗兔,大鼠的二抗。凝集素(lectinFITC)直接與切片孵育(1∶2000,4℃過夜)。以激光共聚焦(德國Leica公司)采集圖像后,利用Bitplane公司的imaris 5.0軟件對圖像進行三維重建,然后分別對紅色和綠色通道上的圖像進行處理,構建isasurface,并拼合圖像。

  2 實驗結果

  2.1 黑質致密部小膠質細胞與多巴胺神經元的空間關系

  熒光顯微鏡觀察發現,黑質致密部中腦腦片可見典型的多巴胺神經元形態,胞體較大,約15~25 μm,胞漿和軸突著色(圖1A);小膠質細胞則呈典型的靜息狀態,胞體很小,突起纖細有多級纖細分支(圖1B)。兩個同視野圖像重合后可觀察二者的位置關系(圖1C),由于圖像為二維,無法識別二者是否有直接接觸。因此對圖像進行數字放大,選取一個包括4個多巴胺神經元胞體和3個小膠質細胞胞體(圖1D)的典型視野,采用常規方法觀察三維位置關系,即用圖像分析軟件中的切片功能,可以對任意點進行深度分析,在z軸(此處定義為深度軸)觀察物體之間的關系。在所選的層面上,均有小膠質細胞和神經元的直接接觸(圖1E)。三維重建后,小膠質細胞的突起直接接觸多巴胺神經元表面,而且接觸點非常常見(圖1F)。

  2.2 紋狀體小膠質細胞與少突膠質細胞的位置關系

  利用同樣的重建方法,觀察了紋狀體內小膠質細胞和其他類型膠質細胞的關系。首先以抗MBP抗體對紋狀體內的髓鞘進行染色,以顯示少突膠質細胞及其突起,同時染色cd11b,觀察小膠質細胞與之的位置關系。首先在冠狀面切片上,圖2A為重建之前的圖像,圖2B為對紅色通道重建的圖像,顯示小膠質細胞形態和分布,圖2C為對兩個通道重建并拼合的圖像。可見髓鞘表面分布著密集的小膠質細胞,小膠質細胞突起環繞髓鞘束,并游走于髓鞘纖維之間,與之保持著密切接觸。在白質纖維矢狀面切面的腦片上,同樣可以觀察到同樣的情況。圖2D為未重建之前的圖像,圖2E為對紅色通道進行重建的圖像,圖2F為對紅色和綠色重建并拼合后的圖像。共聚焦圖像上觀察到單個小膠質細胞突起形成的閉合圓環 (圖2G箭頭所示),在重建的圖像中也可以看到(見圖2E同樣位置)。為鑒定是否此環路來自單個小膠質細胞,對這一區域進行三維重建,發現隨著改變觀察角度(圖2H為45度角,圖2I為15度角),可以清楚地辨別出這并非是同一小膠質細胞構成的突起環路,而是來自不同小膠質細胞的突起互相重疊造成的。以GFAP對星形膠質細胞免疫熒光染色與cd11b雙標后重建,也可發現小膠質細胞與星形膠質細胞間的緊密聯系(圖2J~2L)。靜息狀態下,小膠質細胞有多級分支,環繞星形膠質細胞的胞體;星形膠質細胞呈梭形,突起細長,細胞核較小(圖2L)。圖1 小膠質細胞與多巴胺神經元的位置關系綠色通道顯示多巴胺神經元,紅色顯示小膠質細胞。A、B、C為熒光顯微鏡下觀察到的同一視野圖像,A顯示多巴胺神經元,B顯示小膠質細胞,C為疊加的圖像;D、E、F為同一視野圖像,D為原始激光共聚焦疊加圖像,未進行三維重建;E為最常用的觀察位置關系的方法,切片法,在兩個軸可以看到z軸的位置關系;F為三維重建后的圖像

  2.3 小膠質細胞活化對其他細胞類型的影響

  秋水仙素紋狀體內注射1周后,小膠質細胞體現典型的活化形態(圖3):去分支化,呈橢圓形,細胞核與胞體變大,轉化為腦內的吞噬細胞阿米巴狀細胞,提示其活躍的吞噬行為。免疫熒光染色發現,較多小膠質細胞包裹髓鞘,并將其囊括入胞體(圖3B,3C),髓鞘及纖維隨之逐漸解體。抗GFAP抗體同時免疫熒光染色星形膠質細胞,也發現小膠質細胞活化的形態(圖3E,3F),伴隨星形膠質細胞反應性增生,胞體變圓變大,突起縮短,數量增加(圖3E,3F)。活化后的星形膠質細胞的突起投射到小膠質細胞(圖3E',3F'),而且包繞其胞體(圖3E黑色箭頭圖2 小膠質細胞與髓鞘細胞和星形膠質細胞的空間位置關系紅色通道均顯示小膠質細胞,A、B、C、D的綠色通道顯示髓鞘細胞;J、K、L的綠色通道顯示星形膠質細胞。A、B、C為同一視野圖像,來自神經纖維冠狀切面:A為原始共聚焦疊加圖像,B僅顯示紅色通道,C為兩個通道同時顯示。D、E、F、G為同一視野圖像,來自神經纖維矢狀切面:D為原始共聚焦疊加圖像,E僅顯示紅色通道,F為兩個通道同時顯示,G為原始共聚焦紅色通道圖像,箭頭示小膠質細胞閉合環路樣結構。H、I為三維重建后放大的圖像,前者為45度視角,后者為15度視角,90度角可見E,箭頭示環路樣組成部分并不在同一平面。J、K、L為同一視野圖像,J為原始共聚焦疊加圖像,K為綠色通道三維重建后圖像,顯示星形膠質細胞形態,L為三維重建后雙通道疊加圖像

  A、B、C為同一視野圖像,綠色顯示髓鞘,紅色顯示小膠質細胞,D為原始共聚焦疊加圖像;E為三維重建后疊加圖像,F為E翻轉后的圖像,即E的后面觀。D、E、F為同一視野圖像,綠色顯示星形膠質細胞,紅色顯示小膠質細胞,D為原始共聚焦疊加圖像;E為三維重建后疊加圖像,F為E翻轉后的圖像,即E的后面觀。E'和F'分別為E和F的局部放大,白色箭頭顯示星形膠質細胞發出突起延伸到小膠質細胞表面,黑色箭頭顯示星形膠質細胞包裹小膠質細胞。G為四種顏色熒光同時疊加的圖像,顯示中腦黑質致密部。黃色為多巴胺神經元,綠色為毛細血管和小膠質細胞,紅色為星形膠質細胞,藍色為細胞核推測星形膠質細胞反應增生后可能發揮了炎癥調節功能,與活化小膠質細胞相似,作為腦內的免疫細胞成分發揮作用。為進一步研究小膠質細胞與周圍細胞的關系,采用4個熒光通道同時標記,即以lectinFITC染色毛細血管和小膠質細胞,紅色(羅丹寧或cy3)染色星形膠質細胞,以cy5標記的二抗染色多巴胺神經元,最后以Hoechst染色所有細胞核,共標結果顯示這是可行的(圖3G)。

  3 討論

  在熒光顯微鏡下所采集圖像提供的均為二維信息,只能用于觀察二者是否有共定位,而很難分析觀察目標三維空間的位置關系。激光共聚焦則可通過斷層掃描的方法對切片進行逐層掃描,獲得不同層面的二維信息,使對切片進行三維重建成為可能。Bitplane的Imaris系列模塊是生命科學領域中的顯微圖像分析中,多維圖像處理和分析的主導軟件,是目前最方便的三維細胞結構生物顯微影像分析處理軟件[7]。對切片進行分層,分通道掃描后,可以直接導入imaris軟件,進行圖像分析。我們主要利用其三維成像的功能觀察小膠質細胞與中樞神經系統其他細胞類型的位置關系。

  小膠質細胞作為中樞神經系統抵抗炎癥的第一道防線,負責清除死亡細胞,并在遇到危險信號的時候,招募T細胞,表達免疫球蛋白分子和補體受體,其突起處于動態變化中,不斷對環境進行檢測,為大腦提供了一道有效的預警系統[8,9]。我們的研究結果與此一致:在靜息狀態下,小膠質細胞與神經元、髓鞘和星形膠質細胞有緊密的、直接的接觸。但我們的結果對小膠質細胞與其他細胞的聯系提供了更加詳細、精確和直觀的描述,這為研究不同神經元對炎癥易感性,不同疾病或損傷狀態下小膠質細胞的不同功能,以及腦內不同結構小膠質細胞密度提供了新的手段和視角。

  眾多證據提示星形膠質細胞和小膠質細胞互相影響,以協同的方式處理來自外界和內環境中的信息。有關小膠質細胞和星形膠質細胞相互作用,在AD中體現得尤為明顯。在AD病變中,小膠質細胞在老年斑中富集,周圍同樣有很多星形膠質細胞。小膠質細胞對損傷因素非常敏感,通過釋放細胞因子(如IL1beta,TGFbeta,TNFα),有毒物質或增加吞噬功能,來維持內環境穩定。由于小膠質細胞自身表達這些細胞因子的受體,而星形膠質細胞在細胞因子刺激下,也表達一些細胞因子,如集落刺激因子[10],促進其增生,這樣小膠質細胞和星形膠質細胞通過細胞因子進行交流,形成膠質細胞自分泌或旁分泌的調節模式[11]。Shih等[13]的研究支持這個觀點,他們發現星形膠質細胞培養基能夠顯著降低小膠質細胞對氧化應激的反應,其機制是星形膠質細胞培養基通過活化小膠質細胞內的轉錄因子Nrf2,促進抗氧化應激基因的表達,從而降低氧化自由基的產生。這個調節途徑作為一個反饋抑制來防止小膠質細胞產生過多氧化自由基,從而減少對神經元的非特異損傷[12,13]。

  雖然以上的證據都表明星形膠質細胞和小膠質細胞之間存在信息的交流,但都沒有關注二者之間相互影響的具體過程和方式,僅認為通過旁分泌的方式相互影響。在中樞神經系統的局部組織,各種類型的細胞空間位置需要嚴格按照其結構和功能進行排列,即便作為分泌細胞的膠質細胞,其空間位置關系必定與其功能緊密相關。我們三維重建的圖像提示二者之間的密切接觸很可能是其發揮功能的活躍部位。如果某些信息需要星形膠質細胞和小膠質細胞直接接觸才能傳遞,這種信息傳遞的結構就非常類似于突觸(神經突觸、免疫突觸)。基于這些信息,我們很粗略地提出一個假說:星形膠質細胞和小膠質細胞之間信息交流可能由一種我們稱之為膠質突觸(interglial synapse)的結構來介導(圖4),作為一種特化的結構,介導不同功能狀態下二者的信息交流。但必須承認,這個觀點仍是一個比較初步的假說,需要進一步的形態學和功能實驗證據予以證實。

  總之,我們的研究證實了激光共聚焦逐層掃描和三維成像技術結合的巨大優勢,通過三維成像能更加清晰和準確的把握組織中各種細胞間的空間位置關系,尤其對于神經系統,這種空間位置關系高度有序的結構,更適合用三維成像技術來研究其微觀結構。雖然我們只采用兩個顏色通道進行重建,但四個通道是完全可行的,甚至可以實現5~6個不同的熒光染料的同時染色。在這方面的探索有助于更加全面的分析組織中的細胞構成,相互聯系和功能。免疫熒光、共聚焦顯微鏡和三維重建技術,極大擴展了組織學研究的領域[14],實際上,這些技術實現了組織學和解剖學的結合,利用組織學技術在微觀尺度上對神經系統進行解剖,其應用前途非常廣闊。圖4 提出的假說星形膠質細胞與小膠質細胞相互接觸,形成膠質突觸。與其他類型中樞神經系統細胞不同,星形膠質細胞活化后不僅接受小膠質細胞的突起,還發出突起到小膠質細胞的胞體,這一位置的不同可能提示其功能的差別,星形膠質細胞很可能與小膠質細胞有交互聯系,依賴特定的結構以實現信息的及時有效溝通,從而協同調節炎癥反應

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