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細菌細胞DNA中堿基成分的高效液相色譜測定法的研究

來源:INTERNET 作者:向仲朝 鄧明林 岳蘊瑤等 2005-7-26

摘要: 【摘要】 目的 建立細菌細胞DNA中堿基成分的高效液相色譜定量測定方法。 結果 優選細胞DNA中堿基成分測定的最佳實驗條件,建立簡便、快速、靈敏、精密度好、準確度高、抗干擾能力強的高效液相色譜測定方法。 結論 本法可用于細菌細胞DNA中堿基成分的測定。 高效液相色譜法測定細胞DNA中的堿基成分,有著廣泛的應用前景......


    【摘要】 目的  建立細菌細胞DNA中堿基成分的高效液相色譜定量測定方法。 方法  對其實驗條件,如檢測波長、流動相、方法的線性范圍及最低檢出量、精密度和準確度等方面進行實驗研究。 結果  優選細胞DNA中堿基成分測定的最佳實驗條件,建立簡便、快速、靈敏、精密度好、準確度高、抗干擾能力強的高效液相色譜測定方法。 結論  本法可用于細菌細胞DNA中堿基成分的測定。

   

    高效液相色譜法測定細胞DNA中的堿基成分,有著廣泛的應用前景,可用于細菌、病毒、真菌微生物的核酸研究。它能對表型特性相似,臨床生化反應相同,難以鑒別的細菌,尤其是對一個新菌種作出輔助鑒定 [1] 。本文對高效液相色譜測定DNA中堿基成分鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)的方法進行了研究,對部分細菌細胞DNA中的堿基成分進行了測定,現報告如下。

    1 實驗部分

    1.1 儀器及工作參數 HP1100LC液相色譜儀,HP chemsta-tion色譜數據工作站,UV—可見紫外檢測器,在線脫氣;色譜柱:ODS C 18 Hypersil5μm250×4mm;流動相:甲醇(A)+0.02mol/L乙酸銨(B),梯度洗脫,見表1;檢測波長254nm;柱溫:室溫;流速:1.0ml/min;進樣量20μl。

    表1 梯度洗脫(略)
 
    1.2 試劑 甲醇:經濾膜(0.45μm)過濾;0.02mol/l乙酸銨溶液稱1.54g乙酸銨,加水溶解并稀釋至1000ml,經濾膜(0.45μm)過濾;鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)標準溶液:各稱50.0mg,加磷酸2.5ml,加10ml水,加熱至80℃溶解并用水稀至50.0ml,即成1.00mg/ml混合儲備液。

    1.3 細菌DNA游離堿基的制備 [2,3] 及測定 取分離、純化的菌株適量,經溶解、沉淀蛋白等,抽提出DNA,按干品約0.5mg(濕品約50mg)加72%高氯酸1.0ml,完全溶解后,在沸水溶中水解40min,冷卻后,用水稀釋2倍測定。

    1.4 標準的測定 取鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)各為1.00mg/ml標準混合儲備液稀釋成0.010mg/ml和0.10mg/ml標準應用液。取0.010mg/ml標準應用液0,1.00,5.00,10.0ml以及0.10mg/ml標準應用液5.00,10.0ml,加水至10.0ml,配成鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)各為0,1.00,5.00,10.0,50.0,100(μg/ml)標準系列,進樣20ul測定。

    2 結果分析及討論

    2.1 檢測波長的選擇 經實驗:鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)最大吸收波長在254nm左右,本文選用254nm為測定波長。

    2.2 流動相的選擇 選用甲醇和0.02mol/L乙酸銨溶液作流動相,按表1梯度洗脫,可以完成細菌DNA堿基的完全分離。

    2.3 分離效果 從100ug/ml混合堿基標準的色譜圖(圖1)可知,鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)在254nm測定,可完全分離。胞嘧啶(C)(tR=3.471)、鳥嘌呤(G)(tR=5.390)、胸腺嘧啶(T)(tR=6.072)、腺嘌呤(A)(tR=8.495)。圖2為4號細菌的DNA堿基成分的分離圖。從圖2可以看出,胞嘧啶和腺嘌呤出峰稍有延后現象。

    2.4 線性范圍與最低檢出濃度 胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A))在0~100μg/ml范圍內,濃度C與峰面積(Area)呈直線相關關系。方法的線性范圍、最低檢出濃度見表1、表2。

    表1 標準系列測定值 (濃度μg/ml-峰面積)(略)

    2.5 方法的精密度和準確度 對樣品中胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A))進行了6次測定,結果見表3、表4。

    表3 方法的精密度(略)

    測定值 測定次數 均值 RSD%胞嘧啶(C)2.14~2.24 7 2.18 1.625.4~26.2 6 25.8 1.277.2~78.0 6 77.5 0.36鳥嘌呤(G)2.14~2.40 7 2.26 3.425.0~25.7 6 25.4 1.177.0~77.8 6 77.4 0.37胸腺嘧啶(T)2.30~2.41 7 2.34 1.925.4~26.0 6 25.7 0.8377.0~77.8 6 77.4 0.39腺嘌呤(A)2.29~2.42 7 2.34 2.324.6~25.4 6 25.0 1.577.0~77.7 6 77.4 0.39

    表4 方法的準確度(略)

    2.6 方法的應用 我們于2004年3月9日對江油市疾病預防控制中心提供的已死亡的病豬和感染者(屠宰工)血液中分離出的1~4號細菌以及質控菌株(福氏志賀氏菌X變種)的細胞DNA水解液進行測定,測定結果以mmol/L計(胞嘧啶的分子量為111.1,鳥嘌呤的分子量為151.13,胸腺嘧啶的分子量為126.1,腺嘌呤的分子量為135.13),并計算其G+Cmol%=(G+C)/G+C+2A,見表5。

    表5 細菌DNA游離堿基的測定(略)
    
    根據1~4號細菌的DNA游離堿基的構成,計算G+C mol%值,與相關文獻 [1] 進行比較,結合細菌的生化反應特性,對1~4號細菌初步鑒定為克雷伯氏菌屬,與后來中國疾病預防控制中心的鑒定結果土生克雷伯氏菌相吻合。高效液相色譜法測定細胞DNA中的堿基成分,能對表型特性相似,臨床生化反應相同,難以鑒別的細菌,尤其是對一個新菌種作出輔助鑒定。(本文圖片見附頁1)

    參考文獻

    1 孟昭赫主編.食品衛生檢驗方法注解(微生物學部分).北京:人民衛生出版社,1990,581-614.

    2 許化溪,王勝軍,黃錫金,等.高效液相色譜與熒光法測定細菌染色體堿基組成的比較.中華檢驗醫學雜志,2000,23(4):237-240.

    3 吳新剛,熊深.醫院感染肺炎克雷伯菌的染色體和質粒DNA指紋圖分析.中華檢驗醫學雜志,2003,26(6):252-254.

 

    作者單位:621000四川省綿陽市疾病預防控制中心
    四川省江油市疾病預防控制中心 


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