摘要: 【摘要】 目的 建立細菌細胞DNA中堿基成分的高效液相色譜定量測定方法。 結果 優選細胞DNA中堿基成分測定的最佳實驗條件，建立簡便、快速、靈敏、精密度好、準確度高、抗干擾能力強的高效液相色譜測定方法。 結論 本法可用于細菌細胞DNA中堿基成分的測定。 高效液相色譜法測定細胞DNA中的堿基成分，有著廣泛的應用前景......
高效液相色譜法測定細胞DNA中的堿基成分，有著廣泛的應用前景，可用于細菌、病毒、真菌等微生物的核酸研究。它能對表型特性相似，臨床生化反應相同，難以鑒別的細菌，尤其是對一個新菌種作出輔助鑒定 ［1］ 。本文對高效液相色譜測定DNA中堿基成分鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）的方法進行了研究，對部分細菌細胞DNA中的堿基成分進行了測定，現報告如下。
1 實驗部分
1.1 儀器及工作參數 HP1100LC液相色譜儀，HP chemsta-tion色譜數據工作站，UV—可見紫外檢測器，在線脫氣;色譜柱:ODS C 18 Hypersil5μm250×4mm;流動相:甲醇（A）+0.02mol/L乙酸銨（B），梯度洗脫，見表1;檢測波長254nm;柱溫:室溫;流速:1.0ml/min;進樣量20μl。
表1 梯度洗脫（略）
1.2 試劑 甲醇:經濾膜（0.45μm）過濾;0.02mol/l乙酸銨溶液稱1.54g乙酸銨，加水溶解并稀釋至1000ml，經濾膜（0.45μm）過濾;鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）標準溶液:各稱50.0mg，加磷酸2.5ml，加10ml水，加熱至80℃溶解并用水稀至50.0ml，即成1.00mg/ml混合儲備液。
1.3 細菌DNA游離堿基的制備 ［2，3］ 及測定 取分離、純化的菌株適量，經溶解、沉淀蛋白等，抽提出DNA，按干品約0.5mg（濕品約50mg）加72%高氯酸1.0ml，完全溶解后，在沸水溶中水解40min，冷卻后，用水稀釋2倍測定。
1.4 標準的測定 取鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）各為1.00mg/ml標準混合儲備液稀釋成0.010mg/ml和0.10mg/ml標準應用液。取0.010mg/ml標準應用液0，1.00，5.00，10.0ml以及0.10mg/ml標準應用液5.00，10.0ml，加水至10.0ml，配成鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）各為0，1.00，5.00，10.0，50.0，100（μg/ml）標準系列，進樣20ul測定。
2 結果分析及討論
2.1 檢測波長的選擇 經實驗:鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）最大吸收波長在254nm左右，本文選用254nm為測定波長。
2.2 流動相的選擇 選用甲醇和0.02mol/L乙酸銨溶液作流動相，按表1梯度洗脫，可以完成細菌DNA堿基的完全分離。
2.3 分離效果 從100ug/ml混合堿基標準的色譜圖（圖1）可知，鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）在254nm測定，可完全分離。胞嘧啶（C）（tR=3.471）、鳥嘌呤（G）（tR=5.390）、胸腺嘧啶（T）（tR=6.072）、腺嘌呤（A）（tR=8.495）。圖2為4號細菌的DNA堿基成分的分離圖。從圖2可以看出，胞嘧啶和腺嘌呤出峰稍有延后現象。
2.4 線性范圍與最低檢出濃度 胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A））在0～100μg/ml范圍內，濃度C與峰面積（Area）呈直線相關關系。方法的線性范圍、最低檢出濃度見表1、表2。
表1 標準系列測定值 （濃度μg/ml-峰面積）（略）
2.5 方法的精密度和準確度 對樣品中胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A））進行了6次測定，結果見表3、表4。
表3 方法的精密度（略）
測定值 測定次數 均值 RSD%胞嘧啶（C）2.14～2.24 7 2.18 1.625.4～26.2 6 25.8 1.277.2～78.0 6 77.5 0.36鳥嘌呤（G）2.14～2.40 7 2.26 3.425.0～25.7 6 25.4 1.177.0～77.8 6 77.4 0.37胸腺嘧啶（T）2.30～2.41 7 2.34 1.925.4～26.0 6 25.7 0.8377.0～77.8 6 77.4 0.39腺嘌呤（A）2.29～2.42 7 2.34 2.324.6～25.4 6 25.0 1.577.0～77.7 6 77.4 0.39
表4 方法的準確度（略）
2.6 方法的應用 我們于2004年3月9日對江油市疾病預防控制中心提供的已死亡的病豬和感染者（屠宰工）血液中分離出的1～4號細菌以及質控菌株（福氏志賀氏菌X變種）的細胞DNA水解液進行測定，測定結果以mmol/L計（胞嘧啶的分子量為111.1，鳥嘌呤的分子量為151.13，胸腺嘧啶的分子量為126.1，腺嘌呤的分子量為135.13），并計算其G+Cmol%=（G+C）/G+C+2A，見表5。
表5 細菌DNA游離堿基的測定（略）
根據1～4號細菌的DNA游離堿基的構成，計算G+C mol%值，與相關文獻 ［1］ 進行比較，結合細菌的生化反應特性，對1～4號細菌初步鑒定為克雷伯氏菌屬，與后來中國疾病預防控制中心的鑒定結果土生克雷伯氏菌相吻合。高效液相色譜法測定細胞DNA中的堿基成分，能對表型特性相似，臨床生化反應相同，難以鑒別的細菌，尤其是對一個新菌種作出輔助鑒定。（本文圖片見附頁1）
參考文獻
1 孟昭赫主編.食品衛生檢驗方法注解（微生物學部分）.北京:人民衛生出版社，1990，581-614.
2 許化溪，王勝軍，黃錫金，等.高效液相色譜與熒光法測定細菌染色體堿基組成的比較.中華檢驗醫學雜志，2000，23（4）:237-240.
3 吳新剛，熊深.醫院感染肺炎克雷伯菌的染色體和質粒DNA指紋圖分析.中華檢驗醫學雜志，2003，26（6）:252-254.
作者單位:621000四川省綿陽市疾病預防控制中心
四川省江油市疾病預防控制中心
