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單細胞凝膠電泳技術的改良方法探討

來源:INTERNET 作者:趙忠桂 2005-7-26

摘要: 【摘要】 目的 通過實驗研究,簡化單細胞凝膠電泳(SCGE)實驗步驟。 方法 分別用常規單細胞凝膠電泳技術和改良單細胞凝膠電泳技術,檢測體外H 2 O 2 染毒的小鼠外周血淋巴細胞DNA損傷情況。 結論 改良彗星實驗能使實驗操作步驟簡化,且不影響實驗結果。 單細胞凝膠電泳技術,又名彗星試驗,是近年來發展起來的一種在單......


    【摘要】 目的  通過實驗研究,簡化單細胞凝膠電泳(SCGE)實驗步驟。 方法  分別用常規單細胞凝膠電泳技術和改良單細胞凝膠電泳技術,檢測體外H 2 O 2 染毒的小鼠外周血淋巴細胞DNA損傷情況。 結果  發現兩種實驗所得結果經比較,無顯著差異性(P>0.05)。 結論  改良彗星實驗能使實驗操作步驟簡化,且不影響實驗結果。

    單細胞凝膠電泳技術,又名彗星試驗,是近年來發展起來的一種在單細胞水平上檢測DNA損傷的新方法。Singh氏法為經典的彗星試驗方法,為國內外常用 [1] ,但步驟較多,且受多因素的影響 [2] 。本人經過多次試驗,發現如在常規彗星試驗基礎上稍做修改,將可使實驗步驟更簡單,省時,且不會影響試驗結果。下面為常規彗星試驗和改良彗星試驗分別檢測大鼠外周血淋巴細胞體外H 2 O 2 染毒后DNA損傷情況比較。

    1 材料與方法

    1.1 材料與主要試劑 清潔級昆明種小鼠(湖南農業大學動物部提供);肝素鈉(浙江三利生物制品廠);淋巴細胞分離液(上海化學試劑二廠)等。

    1.2 方法

    1.2.1 受試物處理 取昆明種小鼠40只,平均體重23.16g,雌雄各半,隨機分為兩組,采用股動脈放血法,每只采血約2ml,肝素抗凝,振蕩搖勻后,加于已加淋巴細胞分離液的離心管中(1100pr/min)離心約18min,4℃備用。

    1.2.2 細胞懸液制備 從每離心管中取0.5ml淋巴細胞懸液與0.5ml PBS充分混勻,構成1ml反應體系。

    1.2.3 體外染毒試驗 在1ml反應體系中加H 2 O 2 (8.0mmol/L)于37℃染毒2h后,3000r/min離心8min,棄上清,留約0.5ml,混勻,4℃備用。

    1.2.4 常規彗星試驗操作步驟(詳見參考文獻 [3] ) 膠板制備→裂解→解旋→電泳→中和→染色→脫色→閱片→顯微照像

    1.2.5 改良彗星試驗操作步驟 為節省實驗時間,本研究將鋪三層膠法改為鋪一層膠法,同時在中和及染色等步驟進行了改良,具體操作如下:將已染毒的淋巴細胞懸液與40℃的1%低溶點瓊脂糖等濃度混勻后,取70μl混合液直接滴加在磨毛玻片上,加蓋玻片,4℃冷凝,20min后揭蓋片;4℃于堿性裂解液中裂解1h;解旋20min;4℃電泳(25V,300mA)30min;中和5min;加碘化丙啶,暗處染色10min,加蓋片;于瑩光顯微鏡下鏡檢,照像。

    1.2.6 統計學方法 本研究的結果采用SPSS10.0軟件包處理。

    2 結果 試驗結果見表1。

    表1 兩種方法檢測的小鼠淋巴細胞DNA損傷情況(略)注:拖尾率比較經χ 2 檢驗,P>0.05;彗星遷移度采用LSD方差分析,P>0.05

    3 討論

    從表中可以看出,兩種彗星試驗檢測結果無顯著差異,且改良彗星試驗在鋪膠、中和及染色幾個方面節省時間,提高了實驗成功率,減少了干擾因素。彗星試驗已被廣泛用于各種受試物、射線、生物因素等引起細胞DNA損傷的檢測,DNA損傷與修復研究,致突變劑的初篩等 [4] 。在臨床上主要用于DNA修復缺陷病的診斷,細胞凋亡的檢測,腫瘤放、化療敏感性的監測 [5~6] ,藥效評估以及臨床用藥短期和長期遺傳毒性的評價等,其試驗步驟的簡化將可大大縮短試驗流程,提高工作效率。

    參考文獻

    1 Kassie F,Parzefall W,Knasmuller S.Single cell gel electrophoresis as-say:a new technique for human biomonitoring studies,Mut RES2000,463(1):13-31.

    2 馬愛國,藏金林,劉四朝.單細胞凝膠電泳技術影響因素的分析.中華預防醫學雜志,1999,33(3):165.

    3 趙忠桂.殺蟲劑萬蛾靈對小鼠遺傳物質影響的研究.碩士學位論文.中南大學,2003,5-7.

    4 蔡穎,莊志雄.鎳和鎘對人體外周血淋巴細胞DNA損傷作用.中華預防醫學雜志,1999,33(2):75-77.

    5 王芳,張雙全,戴祝英,等.抗菌肽CM4組分對K562癌細胞染色質DNA斷裂作用的SCGE研究.生物化學與生物物理進展,1998,25(1):64.

    6 Comet assay in genetic ecotoxicology:a review.Environ Mol Mutagen,1999,34(4):246-255.

    作者單位:421001湖南衡陽湖南環境生物學院醫學部


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