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原位雜交檢測湖北鐘祥河南移民及湖北本地居民食管癌組織中HPV

來源:中華醫學研究雜志 作者:黃環元 付由高 姚品芳 李廣燦 夏和順 楊小玲 王 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 檢測湖北鐘祥河南移民及湖北本地居民食管癌組織中人乳頭狀瘤病毒感染情況及感染后的意義。 方法 采用原位雜交法檢測82例食管鱗癌組織中HPV感染。結果 在三組研究對象中均發現有HPV感染,陽性率分別為30。40例正常鱗狀上皮組織中無一例HPV陽性。...


  【摘要】 目的  檢測湖北鐘祥河南移民及湖北本地居民食管癌組織中人乳頭狀瘤病毒感染情況及感染后的意義。 方法  采用原位雜交法檢測82例食管鱗癌組織中HPV感染。同時以40例正常鱗狀上皮組織作正常對照。結果  在三組研究對象中均發現有HPV感染,陽性率分別為30.0%(6/20),25.0%(10/40),31.8%(7/22);40例正常鱗狀上皮組織中無一例HPV陽性。統計學結果顯示實驗組與對照組具有顯著統計學意義(P<0.01),三個實驗組之間無統計學差異(P>0.05)。 結論  湖北鐘祥河南移民和湖北本地居民食管癌組織中存在HPV感染,HPV感染可能與食管癌的發生和進展有關。

  【關鍵詞】  食管癌;人乳頭狀瘤病毒;原位雜交
     
  The compare of HPV infection in esophageal carcinoma in Henan emigration of Hubei Zhongxiang and Hubei native residenter
     
  HUANG Huan-yuan,FUYou-gao,YAO Pin-fang,et al.

  Hubei Cancer Institute,Wuhan,Hubei430079,Chi-na

  【Abstract】 Objective To investigate the HPV infection in esophageal carcinoma in Henan emigration of Hubei Zhongxiang and Hubei native residenter,and their relations to progression of esophageal carcinoma.Methods In-situ hybridization(ISH)was performed in82cases human esophageal carcinoma tissue and40cases normal esophageal tissue was used as normal controls.Results The HPV positive rate was30.0%(6/20),25.0%(10/40),31.8%(7/22)respectively in esophageal carcinoma tissues from Zhongxiang,Hubei native residenter(Macheng),and Hubei cancer hospital.HPV were negative in all40normal esophageal tissue.The positive rate of HPV was significant be-tween experiment group and control group(P<0.01);in the three experiment groups,the expression level of HPVwas no significant(P>0.05).Conclusion HPV positive cells can be found in Hubei Zhongxiang and the other areas;which may contribute to formation of esophageal carcinoma.
   
  【Key words】 esophageal carcinoma;human papillomavirus(HPV);in-situ hybridization(ISH)
      
  許多研究顯示,食管癌的發生與人乳頭狀瘤病毒的感染有關。由于檢測方法、標本來源和標本數量的不同,過去報道的食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)組織中HPV感染的陽性率差異很大。我們采用原位雜交法對食管鱗癌及癌旁組織進行HPV檢測,探討湖北鐘祥河南移民及湖北本地居民食管癌組織中人乳頭狀瘤病毒感染情況及感染后的意義。

  1 材料與方法
    
  1.1 標本來源 收集食管癌高發區湖北鐘祥柴湖鄉衛生院經手術切除的食管鱗狀細胞癌組織存檔蠟塊20例。年齡41~70歲,平均年齡58歲。核查病歷證實,20例患者均為河南移民。
   
  同時收集湖北麻城地區本地食管鱗狀細胞癌患者22例,年齡33~67歲,平均年齡55.7歲。湖北省腫瘤醫院散發的經手術切除的食管鱗狀細胞癌存檔蠟塊40例,年齡37~75歲,平均年齡56.9歲。核查病歷證實,62例患者均為本地籍。
    
  全部標本的組織切片在進行原位雜交檢測前均已進行常規HE染色,由經驗豐富的病理醫生再次病理證實并進行病理分級。采用經病理證實的40例形態學正常的食管狀上皮組織作正常對照。
   
  1.2 方法 蠟塊連續切片,每片5μm厚,分別做HE染色、免疫組化染色和DNA原位雜交。載玻片均使用經多聚賴氨酸處理的玻片。
   
  本實驗采用DAKO公司的K0601HPV原位雜交試劑盒,Y1412生物素標記探針HPV DNA(16/18)。基本參照DAKO公司提供的操作程序進行原位雜交(in-situ hy-bridization,ISH),根據本實驗室條件略做改動。切片脫蠟至水,0.8%胃蛋白酶37℃消化10min,滴加探針HPV DNA(16/18)溶液(15~20μl),蓋上蓋玻片,置PCR儀90℃變性5min后,立即將切片移入預熱的濕盒內37℃雜交60min。浸入TBS溶液,移去蓋玻片,置試劑盒專用清洗液58℃30min中止雜交。TBS洗片,滴加鏈親和素-堿性磷酸酶復合物(Streptavidin-AP)室溫20min,BCIP/NBT底物顯色、避光、60min,核快紅復染,常規封片,鏡檢。鏡下可見HPV DNA陽性細胞核內呈藍黑色微細顆粒。
   
  ISH實驗設以下對照:(1)不加HPVDNA(16/18)探針;(2)雜交后不加鏈親和素-堿性磷酸酶復合物;(3)加HPVDNA(16/18)探針但未經90℃熱變性即進行雜交實驗。

  1.3 結果判定和統計學分析 +表示5%~25%陽性細胞,++表示25%~50%陽性細胞,+++~++++表示陽性細胞>50%。所得結果應用Fisher′s方法精確檢驗
     
  2 結果
    
  食管鱗癌組織的HPVDNA的原位雜交實驗檢測結果見表1。
    
  表1 食管癌組織ISH檢測HPV陽性率(略)
    
  注:①②③之間比較P>0.05(P值=0.903);④與①②③之間比較P<0.01(P值=0.0017)
      
  鐘祥柴湖河南移民的20例ESCC標本中,ISH陽性者6例,陽性率為30.0%(6/20);湖北本地居民標本陽性率為25.0%(10/40);湖北省腫瘤醫院ESCC標本陽性率為31.8%(7/22);所檢測的40例正常上皮組織無一例陽性表達。結果顯示,①②③陽性率之間P>0.05差異無顯著性;④與①②③之間P<0.01差異具有顯著性。
   
  HPV(16/18)DNA陽性雜交點位于細胞核內。在癌巢中,陽性細胞大多位于癌巢中間部分,陽性細胞的形態多為短梭形或不規則形。且細胞形態越不規則陽性表達越高。

  3 討論
    
  食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一,具有明顯的地域性差異,其發生與遺傳、環境、飲食和某些微生物的感染密切相關。許多研究表明,食管癌的發生與HPV感染有關。我們采用高特異性ISH方法檢測湖北鐘祥河南移民、湖北本地居民及本院患者ESCC中HPV感染情況。結果顯示三組實驗標本之間HPV的陽性率沒有明顯差異。光鏡下可見所有HPV DNA陽性細胞均位于腫瘤組織的中央區域,說明ISH檢測到的HPV DNA不是外來感染所致,而是腫瘤細胞核內原本存在的。而三組實驗標本與正常鱗狀上皮組織的HPV感染則具有顯著差異。筆者的研究結果與林俊杰等 [1] 采用DAKO HPV原位雜交試劑盒觀察33例ESCC中HPV DNA24.2%的陽性率基本一致。匡忠生等 [2] 應用型特異性引物PCR檢測56例食管癌組織中HPV16,18的感染率,采用Southern blot雜交檢測HPV16在食管中的存在狀態。結果HPV16,18的感染率分別為39%和2%,并且在部分病例HPV16DNA以整合形式存在。河北食管癌高發區磁縣食管癌患者HPV DNA檢出率為20.3%,雖高于非高發區患者的HPV陽性率(8.3%),但經統計學處理兩者差異無顯著性。該結果與本研究結果相近 [3] 。在本研究中發現鐘祥柴湖河南移民和湖北本地居民及湖北省腫瘤醫院的食管癌患者均有HPV的感染,而三者之間沒有統計學差異。與本實驗采用免疫組化檢測的結果一致 [4] 。提示HPV感染與食管癌有關,可能為食管癌的病因之一。其作用的分子機制有待進一步探討。

  【參考文獻】
    
  1 林俊杰,張錦霞,宗永生.食管鱗狀細胞癌中人乳頭狀瘤病毒感染的意義.廣東醫學院學報,1998,16(3):186-188.
   
  2 匡忠生,唐純志,沈忠英.食管癌患者中HPV16,18的檢測.廣東醫學,2000,21(4):305-306.
   
  3 劉艷麗,李學民,靳國梁,等.河北磁縣食管癌高發區食管鱗狀細胞癌組織HPV檢測及FHIT表達的研究.癌癥,2003,22(5):492-495.
   
  4 姚品芳,黃環元,付由高,等.湖北鐘祥河南移民與湖北本地居民食管鱗狀細胞癌組織中HPV感染的比較.腫瘤防治研究,2005,32(1):46-48.
   
  (編輯悅 銘)

  * 基金項目:湖北省科技廳科技攻關項目資助課題(編號:2004AA304B08)
   
  作者單位:430079湖北省腫瘤研究所(△ 通訊作者)

          湖北省腫瘤醫院病理科
   
          湖北省鐘祥柴湖衛生院

 


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