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胃癌組織中SOX4基因的突變分析

來源:中華醫學研究雜志 作者:王志方葛亞東聶劉旺 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 研究胃癌中SOX4基因的堿基及其編碼的氨基酸突變情況,探討其在胃癌發生中的作用。方法 提取胃癌腫瘤及癌旁組織的DNA,PCR擴增胃癌SOX4基因的HMG-box框,并對其進行PCR-SSCP分析,對有差異的樣本進行DNA測序。 結果 經序列測定發現在27例胃癌樣本中有12例出現點突變,而在癌旁組織中沒有發現突變,晚期胃癌......


  【摘要】 目的  研究胃癌中SOX4基因的堿基及其編碼的氨基酸突變情況,探討其在胃癌發生中的作用。方法  提取胃癌腫瘤及癌旁組織的DNA,PCR擴增胃癌SOX4基因的HMG-box框,并對其進行PCR-SSCP分析,對有差異的樣本進行DNA測序。將測序結果用ClustalX軟件與正常的HMG-box框序列比對,用DNAStar軟件將HMG-box框堿基序列轉化成氨基酸序列,再用ClustalX軟件與正常的氨基酸序列比對。 結果  經序列測定發現在27例胃癌樣本中有12例出現點突變,而在癌旁組織中沒有發現突變,晚期胃癌的突變率明顯高于早期胃癌。 結論  SOX4基因突變可能與胃癌的發展和轉移有相關性。本研究為探索SOX4基因突變與人類腫瘤發生之間的關系提供了分子資料。
    
  【關鍵詞】  胃癌;SOX4;HMG-box;突變
      
  The mutation and sequence analysis of SOX4in gastric carcinoma
     
  WANG Zhi-fang,GE Ya-dong,NIE Liu-wang.

  Anhui Normal University,Anhui241000,China
   
  【Abstract】 Objective To investigate the mutation of SOX4HMG-box in gastric carcinoma tissues and to explore its roles in progression of gastric carcinoma.Methods The DNA of gastric carcinoma tissues and gastric mucosa tis-sues were extracted.HMG-BOX of SOX4gene was amplified by PCR.After PCR-SSCP analyzing,the different samples were sequenced,and translated into peptide,then analyzed by ClustalX software.Results 12out of27gas-tric carcinoma samples have mutations,no mutations have been detected in the paracancerous tissues,mutation rate is higher in terminal stomach cancer than in early stomach cancer.Conclusion This suggests SOX4gene mutations have some relation with the happening of gastric carcinoma.This study gives some molecular information for further research of the relationship between SOX4gene mutation and human cancer.
   
  【Key words】 gastric carcinoma;SOX4;HMG-box;mutation
      
  SOX基因是以SRY基因為基本成員的一類新的控制發育的基因家族 [1] ,在個體發育過程中對性別分化及組織器官形成起重要作用,主要特征為具有一個保守基序HMG-box,可與DNA序列特異結合,是一類重要的轉錄調控因子 [2] 。現階段這方面的研究表明,SOX基因在早期胚胎發育過程中參與多種發育途徑,具有重要的作用,參與諸如性別決定、骨組織的發育、血細胞生成過程、神經系統的發育、晶狀體的發育等多種早期胚胎發育過程 [3] ,故人類SOX基因的突變或缺失會導致發育異常和嚴重的先天性疾病 [4~9] 。因此,對SOX基因的研究不僅可以揭示性別分化和胚胎發育的機制,而且可為某些疾病的診斷和治療提供分子方向的資料,有著非常重要的理論和應用價值。
   
  胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。在中國北方,胃癌死亡率占所有惡性腫瘤死亡率的第一位 [10]。本文在對胃癌組織DNA的SOX4基因進行PCR-SSCP分析時發現,部分病例發生了點突變,導致氨基酸序列發生變化。提示SOX4基因突變或異常表達與消化道腫瘤的發生、發展具有相關性。

  1 材料與方法
    
  1.1 材料來源 27例新鮮胃癌手術切除標本均取自弋磯山醫院外科手術室,其中Ⅰ期8例,Ⅱ期9例,Ⅲ期10例,均未經化療或放射性治療,每例標本包括原發癌腫和距腫瘤邊緣5cm以上的癌旁組織作為對照。經鏡檢,原發癌腫癌細胞在70%以上,癌旁組織無癌細胞。標本置于細胞冷藏袋中-80℃保存。
   
  1.2 基因組DNA提取 用酚/氯仿法提取基因組DNA [11] 。

  1.3 主要試劑和儀器 蛋白酶K、TaqDNA聚合酶(5U/μl)、10×Buffer、MgCl 2 ,dNTP均購于Promega公司。PTC-100PCR儀(MJ Research company)、電泳儀(北京六一儀器廠)、水平板電泳槽(北京六一儀器廠)、TGL-16高速臺式離心機、DU70紫外分光光度計(美國Beckman公司)、TLL-C臺式冷凍離心機(軍事醫學科學院實驗儀器廠)。
   
  1.4 DNA的定量 DNA完全溶解后,吸取5μl DNA溶液,加95μl TE,稀釋100倍,在DU70紫外分光光度計上測定OD260及OD280值。1OD260值相當于50μg/ml的雙鏈DNA,所以DNA濃度為OD260×50μg/ml×100(稀釋倍數),純度依據OD260/OD280比值,小于1.8,說明有蛋白質污染;大于2.0說明有RNA污染。最佳值在1.8~2.0之間。經測定所提取的DNA均符合要求。
   
  1.5 PCR擴增及產物克隆 引物參照人SOX4基因序列設計,A1:5′-GTG TGG TCG CAG ATC GAG CGG C-3′;A2:5′-GCC ACT GCC ACC GAC CTT GTC T-3′,上海生工生物工程公司合成,PAGE純化。該對引物可特異擴增人SOX4基因包括HMG-box在內的約350bp的堿基序列,PCR擴增反應體系25μl,循環參數:95℃預變性5min,94℃40s,62℃50s,72℃1min,30個循環,72℃延伸15min,設陰性對照以檢測是否有外源DNA污染,分別取4μl擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠檢測,拍照,余下的PCR產物用純化試劑盒進行純化。
    
  2 結果
     
  2.1 PCR擴增結果 27個標本中均有擴增產物。片段大小約為350bp,與正常人SOX4基因擴增一致。PCR擴增結果如圖1;SSCP分析結果如圖2。
 
  圖1 PCR擴增結果M:DNA梯度;N:陰性對照(略)
   
  1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13為癌組織,14為正常胃組織
  
  圖2 SSCP分析結果(略)
   
  1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13為癌組織,14為正常胃組織
   
  4、5為SOX4基因發生突變的癌組織

  2.2 測序結果 PCR產物經純化后由上海博亞生物技術有限公司測序,測序結果與正常SOX4序列比對,發現癌旁組織中無突變,而在癌組織中有12例有點突變,根據突變位點差異分為A、B、C、D四種類型,如圖3所示。胃癌組織中SOX4基因四種突變類型編碼氨基酸序列比較見圖4。
    
  3 討論
    
  SOX基因在哺乳動物進化中(包括人)是高度保守的,而其兩側的堿基變異較大,由此基因編碼的一種蛋白質包含一個由70多個氨基酸殘基組成的DNA結合區域,即HMG-box,HMG-box區的氨基酸也是高度保守,兩側表現很大的差異。SOX4基因屬于SOX基因家族的C組,主要參與心臟管腔發育和B細胞發育。目前研究表明,SOX4基因的異常表達與多種疾病的發生有關,如急性髓細胞白血病、急生乳腺腫瘤、結腸癌、小細胞肺癌等 [12] 。SOX4基因的HMG結構域長79個氨基酸殘基,可以以序列特異的方式與DNA的小溝結合使其產生較大的彎曲,從而調節靶基因的表達,所以相應的HMG盒內的突變(如錯義突變)將影響其對下游調控基因的DNA序列的特異識別和結合,進而影響SOX4蛋白正常轉錄激活功能,導致疾病的發生。
   
  本研究對胃癌組織標本DNA進行PCR擴增并測序發現,在27例標本中共有12例發生突變,且都為癌組織,癌旁組織中沒有發現突變。根據突變位點差異,我們將其分成四種類型,A型5例:有7個點突變位點,分別是10451bp處C-A,10669bp處G-A,10682bp處G-C,10688bp處C-G,10702bp處C-A,10703bp處T-C,10706bp處C-T;B型3例:有6個突變位點,10669bp處G-T,10702bp處C-T,而10682bp、10688bp、10703bp、10706bp的突變與A型一致;C型3例:4個突變位點,分別是10682bp、10688bp、10703bp、10706bp,突變與A、B一致;D型1例:只有一個突變位點,位于10677bp處,由G-C。在所有突變中,只有A型的10451bp、10669bp和B型的10669bp處的突變在HMG盒內,其余均在HMG盒外。
   
  對氨基酸序列分析發現,A型中10669bp處突變導致精氨酸(R)突變為谷氨酰胺(Q),10702bp處突變導致丙氨酸(A)突變為天冬氨酸(D);B型中10669bp處突變導致精氨酸(R)突變為亮氨酸(L),10702bp處突變導致丙氨酸(A)突變為纈氨酸(V);D型10677bp處突變導致谷氨酸(E)突變為谷胺酰氨(Q);其余的均為同義突變,氨基酸沒有發生改變。從氨基酸的突變可以看出:精氨酸為堿性氨基酸,帶正電荷,當突變為不帶電荷的谷氨酰胺,不利于SOX4基因與DNA的結合;丙氨酸為非極性氨基酸,位于疏水核內,對于維持蛋白質三級結構的穩定起重要作用,若突變為極性荷電的氨基酸-天冬氨酸,則破壞疏水作用,導致高級結構的解體,從而失去結合DNA的能力;精氨酸突變為中性氨基酸亮氨酸,同樣不利于與DNA的結合;纈氨酸雖然也是中性氨基酸,但其結構要比丙氨酸大得多,因而使得整個肽鏈結構趨于松散,不利于與DNA的結合。所以可以推測突變導致SOX4基因與DNA的結合能力下降,影響了SOX4蛋白正常轉錄激活功能,導致其不能對下游調控基因的DNA序列特異識別和結合。推測這些突變可能與胃癌的進展和轉移有一定的關系。
 
  圖3 胃癌組織中SOX4基因四種突變類型DNA序列的比較(略)
   
  27例病例中有12例發生突變,總突變率44.4%,其中Ⅰ期8例僅有2例突變,突變率25%,分別為D型1例和C型1例。Ⅱ期9例有4例突變,突變率44.4%,分別為B型2例和C型2例。Ⅲ期10例有6例突變,突變率60%,分別為A型5例和B型1例。仔細分析可以發現,突變多出現在臨床Ⅱ、Ⅲ期,即晚期胃癌的突變率和突變位點明顯高于早期胃癌。提示SOX4突變可能與胃癌的進展和轉移具有相關性。因此深入研究SOX4基因與胃癌的關系,將有十分重要的意義。
 
  圖4 胃癌組織中SOX4基因四種突變類型編碼氨基酸序列比較(略)

  【參考文獻】
    
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  3 常重杰,周榮家,余其興.SOX基因的研究現狀.遺傳,2000,22(1):51-53.
   
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  11 分子克隆實驗指南(上、下冊)/(美)薩姆布魯克(Sambrook,J)等著;黃培堂等譯.第三版.北京:科學出版社,2002,8.
   
  12 陳啟龍.SOX基因突變和異常表達與疾病發生的研究.中國醫學生物技術應用雜志,2004,7:41-47.
  
  (編輯建 光)

  * 基金項目:安徽省教育廳自然科學基金重點項目(2002kj128),安徽省自然科學基金(No.01043202)
   
  作者單位:241000安徽蕪湖安徽師范大學生命科學學院(△ 通迅作者)


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