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斯普瑞達(SPRIDA)對SMMC-7721肝癌細胞生長和粘附功能的影響

來源:中華醫學研究雜志 作者:劉培勛周則衛徐文清劉曉秋劉正明李松年 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 目的 使用SMMC-7721肝癌細胞株對SPRIDA-A、SPRIDA-B和SPRIDA-A+SPRIDA-B體外抑制腫瘤生長和粘附功能進行研究。 方法 采用MTT比色分析法觀察SPRIDA-A、SPRIDA-B、SPRIDA-A+SPRIDA-B對SMMC-7721肝癌細胞生長和粘附功能的影響,測定其生長抑制率和粘附抑制率。 結果 SPRIDA-A對SMMC-7721肝癌細胞生長抑制作用不明顯......


  【摘要】 目的  使用SMMC-7721肝癌細胞株對SPRIDA-A、SPRIDA-B和SPRIDA-A+SPRIDA-B體外抑制腫瘤生長和粘附功能進行研究。 方法  采用MTT比色分析法觀察SPRIDA-A、SPRIDA-B、SPRIDA-A+SPRIDA-B對SMMC-7721肝癌細胞生長和粘附功能的影響,測定其生長抑制率和粘附抑制率。 結果  SPRIDA-A對SMMC-7721肝癌細胞生長抑制作用不明顯,SPRIDA-B和SPRIDA-A+SPRIDA-B對肝癌細胞生長有明顯抑制作用,并呈劑量依賴關系;SPRIDA-B對SMMC-7721肝癌細胞粘附功能有明顯抑制作用,并呈劑量依賴關系。SPRIDA-B作用于SMMC-7721肝癌細胞后,可見明顯的凋亡細胞形態出現。 結論  SPRIDA-B對SMMC-7721肝癌細胞生長和粘附功能有明顯抑制作用,并可誘導細胞凋亡,是一個極具研究價值的抗腫瘤及抗轉移的新藥。
    
  【關鍵詞】  SPRIDA-A;SPRIDA-B;肝癌細胞;轉移;粘附;凋亡
   
  Effects of SPRIDA on growth and adhesion of hepatoma cell SMMC-7721
    
  LIU Pei-xun,ZHOU Ze-wei,XUWen-qing,et al.

  Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Tianjin300192,China
   
  【Abstract】 Objective Study on SPRIDA-A,SPRIDA-B and SPRIDA-A+SPRIDA-B inhibit growth and adhesion of tumor in vitro by using hepatoma cell line SMMC-7721.Methods MTTwas used to investigate the ef-fect of SPRIDA-A,SPRIDA-B,SPRIDA-A+SPRIDA-B on growth and adhesion of hepatoma cell SMMC-7721,and detect the inhibition rate of growth and adhesion.Results SPRIDA-A could not obviously inhibit the growth of hepatoma cell SMMC-7721,SPRIDA-B and SPRIDA-A+SPRIDA-B could obviously inhibit the growth and adhesion of hepatoma cell SMMC-7721in a dose dependent manner.It was clear that SPRIDA-B could induce the apoptosis of the cells,when it was used on hepatoma cell SMMC-7721.Conclusion SPRIDA-B that could obviously inhibit the growth and adhesion of hepatoma cell SMMC-7721and induce the apoptosis of the cells,was an antitumor and antimetastasis drug with remarkable value for study.
   
  【Key words】 SPRIDA-A;SPRIDA-B;hepatoma cell;metastasis;adhesion;apoptosis
      
  苦豆子Sophor alopecuroides L為豆科槐屬植物,在我國西北地區分布廣泛。我們從其全草中提取、分離得到生物堿I,并經半合成、純化制備得SPRIDA-A和SPRIDA-B,SPRIDA-A和SPRIDA-B為同分異構體。SPRIDA-A為人工構型,SPRIDA-B為天然構型。兩者由于構型不同,生物活性也可能不同,為了驗證其體外抗腫瘤和抗腫瘤轉移作用,我們利用SMMC-7721肝癌細胞進行了其體外抗腫瘤及抗轉移作用的研究 [1~3] 。

  1 材料與方法

  1.1 材料
   
  1.1.1 藥物 SPRIDA-A、SPRIDA-B,均為白色固體粉末,引吸濕性強,溶于水,純度大于95%,由本實驗室自制。

  1.1.2 主要試劑 RPMI—60培養基、小牛血清、胰蛋白酶、MTT、二甲基亞砜(DMSO)購于中國醫學科學院血液學研究所,ECMGEL購自sigma公司。
   
  1.1.3 細胞系 SMMC-7721肝癌細胞株,購于中國醫學科學院基礎醫學研究所。

  1.2 方法
   
  1.2.1 細胞培養 SMMC-7721肝癌細胞常規培養于10%小牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml鏈霉素的RPMI—60培養基中,置于37℃CO 2 培養箱內培養,2~3d傳代1次,以維持細胞處于對數成長期。
   
  1.2.2 SPRIDA-A、SPRIDA-B、SPRIDA-A+SPRIDA-B對SMMC-7721肝癌細胞生長的影響 采用噻唑氮藍(MTT)比色分析法。將對數生長期細胞接種于96孔培養板,細胞濃度為8×10 4 /ml,每孔0.2ml,將SPRIDA-A、SPRI-DA-B、SPRIDA-A+SPRIDA-B與細胞共培養24h,加150μl DMSO,全自動酶標儀測定波長490nm光密度(A)值,每孔設6個復孔。試驗重復三次,計算各組均值。試驗組按下式計算細胞生長抑制率:
   
  生長抑制率(%)=(1-試驗組A值/對照組A)×100%
   
  1.2.3 SPRIDA-A、SPRIDA-B對SMMC-7721肝癌細胞粘附功能的影響 采用噻唑氮藍(MTT)比色分析法。96孔板每孔中分別鋪上ECM CEL各50μl,4℃過夜。加入1%BSA150μl/孔,37℃孵箱內孵育2h,倒置瀝干。9002與細胞共培養24h,調節細胞濃度為8×10 4 /ml,每孔加0.2ml,吸附1h,用無血清培養液洗2次,加入200μl完全培養液,加MTT20μl/孔,37℃孵箱內孵育4h,加DMSO150μl/孔。全自動酶標儀測定波長490nm的光密度(A)值,每孔設4個復孔,試驗重復二次,計算粘附抑制率:粘附抑制率(%)=(1-加藥組A值/未加藥組A值)×100%
   
  1.2.4 SPRIDA-A、SPRIDA-B對SMMC-7721肝癌細胞形態的影響 將對數生長期細胞接種于預先置有蓋玻片的6孔培養板內,細胞濃度為8×10 4 /ml,每孔2ml,SPRIDA-A、SPRIDA-B終濃度分別為3.7879×10 -4 mol/L、1.1364×10 -3 mol/L、2.2727×10 -3 mol/L與細胞共培養24h,取出蓋玻片,Ciemsa染色后光鏡下進行細胞形態學觀察 [4,5] 。

  2 試驗結果
    
  2.1 SPRIDA-A、SPRIDA-B單用SMMC-7721肝癌細胞的生長抑制作用 見表1。
    
  表1 SPRIDA-A、SPRIDA-B單用SMMC-7721肝癌細胞的生長抑制作用(略)
    
  由表1可見,SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞生長的抑制作用大于SPRIDA-A。隨著SPRIDA-B藥物濃度增大,抑制率也明顯增加,并呈劑量依賴關系。當藥物濃度為1.1364×10 -3 mol/L時,抑制率可達60%。兩組比較,差異有顯著性(P<0.05)。
   
  2.2 SPRIDA-B、SPRIDA-A+SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞的生長抑制作用 見表2。
    
  表2 SPRIDA-B、SPRIDA-A+SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞的生長抑制作用(略)
    
  由表2可見,SPRIDA-B,SPRIDA-A+SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞的生長均有抑制作用,并呈劑量依賴關系,但在同一劑量條件下相比,SPRIDA-A+SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞的生長抑制作用更加明顯,但兩組比較,P>0.05,差異無顯著性。
   
  2.3 SPRIDA-A,SPRIDA-B,SPRIDA-A+SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞的生長抑制作用 見表3。
    
  表3 SPRIDA-A,SPRIDA-B,SPRIDA-A+SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞的生長抑制作用(略)
    
  由表3可見,SPRIDA-A對SMMC-7221肝癌細胞生長抑制作用不明顯,而SPRIDA+SPRIDA-B和SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞生長均有明顯的抑制作用,并呈劑量依賴關系。當藥物濃度為1.1364×10 -3 mol/L時,抑制率SPRIDA-B為54%,SPRIDA+SPRIDA-B為64%。但組間比較,差異無顯著性(P>0.05)。
   
  2.4 SPRIDA-A、SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞粘附功能的影響 見表4。
     
  粘附能力是癌細胞侵蝕的始動步驟,高侵襲的腫瘤細胞與基底膜成分的異質性粘附能力通常增高,而腫瘤細胞間的同質性粘附能力則會下降。粘附試驗表明,20min即可見SPRIDA-A組成部分細胞貼壁粘附,而SPRIDA-B組細胞仍處于圓形的懸浮狀態。在本試驗劑量范圍內,SPRIDA-A對肝癌細胞的粘附功能沒有明顯影響。SPRIDA-B對肝癌細胞的粘附功能有明顯抑制作用,并呈劑量依賴關系。當SPRIDA-B藥物濃度為3.7879×10 -4 mol/L、1.1364×10 -3 mol/L、2.2727×10 -3 mol/L時,粘附抑制率分別為68%、90%、77%,與SPRIDA-A相比差異有顯著性(P<0.05)。
   
  2.5 SPRIDA-B、環磷酰胺對SMMC-7221肝癌細胞的生長抑制作用 見表5。
     
  表4 SPRIDA-A、SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞粘附功能的影響(略)
    
  表5 SPRIDA-B、環磷酰胺對SMMC-7221肝癌細胞的生長抑制作用(略)
    
  在本試驗劑量范圍內,環磷酰胺對SMMC-7221肝癌細胞的增值作用不明顯。而SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞有明顯抑制作用,并呈劑量依賴關系。當SPRIDA-B藥物濃度為4.3030×10 -3 mol/L時,抑制率可達67%。但兩組相比,P>0.05,差異無顯著性。
   
  2.6 SMMC-7221肝癌細胞的形態學觀察 觀察不同濃度的SPRIDA-A、SPRIDA-B作用于SMMC-7221細胞24h后發現,SPRIDA-A組細胞形態大而有規則,核質比大,染色質深而致密,并且視野中細胞數目很多,而SPRIDA-B組細胞稀疏,數目少,形態不規則,有的呈梭形,有的呈圓形,核質比大,染色質較疏松。當SPRIDA-B濃度為1.1364×10 -3 mol/L時,可見有明顯的凋亡細胞形態出現;細胞體積明顯變小,薄膜皺縮,胞核固縮,染色質濃染,有的細胞表現為核碎裂,個別細胞部分胞漿崩解為碎片狀,可見由膜裹內容物的所謂凋亡小體形成。
    
  3 結論
    
  試驗結果表明:(1)SPRIDA-A單用對SMMC-7221肝癌細胞的生長抑制作用不明顯。(2)SPRIDA-B單用對SMMC-7221肝癌細胞的生長抑制有明顯作用,隨著SPRI-DA-B藥物濃度增大,抑制率也明顯增加,并呈劑量依賴關系,與SPRIDA-A相比,兩組間相比,P<0.05,差異具有顯著性。(3)SPRIDA-A+SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞生長有明顯的抑制作用,并呈劑量依賴關系。與SPRIDA-B單用相比,P>0.05,兩組間差異無顯著性。(4)粘附試驗表明,SPRIDA-A對肝癌細胞的粘附功能沒有明顯影響,SPRIDA-B對肝癌細胞的粘附功能有明顯抑制作用,并呈劑量依賴關系。與SPRIDA-A相比差異有顯著性(P<0.05)。(5)在試驗劑量范圍內,環磷酰胺對SMMC-7221的抑制作用不明顯,而SPRIDA-B對SMMC-7221肝癌細胞有明顯抑制作用,并呈劑量依賴關系。但兩組相比,P>0.05,差異無顯著性。(6)不同濃度的SPRIDA-A作用于SMMC-7221肝癌細胞后,細胞形態大而規則,核質比小,染色質深而致密,并且視野中細胞數目很多。而SPRIDA-B組細胞稀疏,數目少,形態不規則,核質比大,染色質較疏松。當SPRIDA-B濃度為1.1364×10 -3 mol/L時,可見明顯的凋亡細胞形態出現。
    
  4 討論
    
  SPRIDA-A與SPRIDA-B由于立體結構不同,可能表現為不同的生物活性,試驗結果證實了這一點。可能與底物與受體作用有關。因為從結構上講,SPRIDA-A具剛性,而SPRIDA-B具柔性,SPRIDA-B易與受體作用。所以SPRIDA-B活性更強。
   
  SPRIDA-B不僅對SMMC-7221肝癌細胞生長有明顯的抑制作用,而且對其粘附功能也有明顯抑制作用,并可誘導細胞凋亡,從而影響腫瘤細胞的侵襲和轉移,SPRIDA-B是一個很有開發價值的抗腫瘤及抗轉移藥物,值得深入研究。 

  【參考文獻】
    
  1 衛生部《新藥(西藥臨床前研究指導原則匯編(藥學、藥理學、毒理學)》.1993,137.
   
  2 周則衛,劉培勛,徐文清,等.苦豆子生物堿衍生物9002急性毒性及體內抑癌活性的實驗研究.海峽藥學,2003,15(4):14-16.

  3 高虎,陳嘉嶼,余西林.藥物誘導細胞凋亡治療肝癌.世界華人消化雜志,2001,9(6):686-688.
   
  4 魯翠濤,梅興國,龔偉,等.紅豆杉細胞提取物對腫瘤細胞SMMC-7721和HEp-2的作用研究.中國藥理學通報,2003,19(7):801-803.
   
  5 丁志山,高承賢,陳鈮鈹,等.姜黃素具有抑制血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡雙重作用.中國藥理學通報,2003,19(2):171-173. 

  (編輯:秋 實)
  
  作者單位:300192天津,中國醫學科學院中國協和醫科大學放射醫學研究所


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