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腸球菌隨機擴增多態性DNA分型及應用研究

來源:中華醫學研究雜志 作者:蔣漢茂肖湘瑛周維新張艷 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 建立隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)分型技術,對腸球菌進行基因分型,探討RAPD在分子流行病學中的應用,并探討腸球菌的基因分型及其與耐藥性的關系。 方法 對醫院臨床標本中分離的64株腸球菌進行RAPD基因分型,并分析基因型與耐藥性的關系。 結果 RAPD分型結果顯示,經優化......


  【摘要】 目的  建立隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)分型技術,對腸球菌進行基因分型,探討RAPD在分子流行病學中的應用,并探討腸球菌的基因分型及其與耐藥性的關系。 方法 對醫院臨床標本中分離的64株腸球菌進行RAPD基因分型,并分析基因型與耐藥性的關系。 結果  RAPD分型結果顯示,經優化的RAPD分型技術能有效地對腸球菌進行基因分型,分型率為100%。64株腸球菌根據擴增片段的差異分為8種基因型。以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ型為主,共占81.4%。Ⅰ、Ⅷ型具有對β內酰胺類抗生素和高水平氨基糖苷類抗生素耐藥。Ⅳ型具有對β-內酰胺類抗生素耐藥。Ⅲ、Ⅶ具有對高水平氨基糖苷類抗生素耐藥。Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型具有對β-內酰胺類抗生素、高水平氨基糖苷類抗生素、糖肽類抗生素敏感。 結論  RAPD分型技術是一種特異、敏感、簡便快速、分辨力強、分型率高、重復性好的分型方法。可有效地對腸球菌進行基因分型,并且腸球菌的RAPD分型與其耐藥性有一定關系。
      
  【關鍵詞】  腸球菌;隨機擴增多態性DNA;基因分型
     
  Study on typing of enterococcus by random amplified polymorphic DNA and its application
     
  JIANG Han-mao,XIAO Xiang-ying,ZHOU Wei-xin,et al.

  Department of Laboratory Sicence,the People's Hospital of Yongzhou,Hunan425000,China
   
  【Abstract】 Objective To establish the random amplified polymorphic DNA(RAPD)genotyping,to discuss its role in molecular epidemiology.And to investigate the correlation of genotypes of enterococcus and its phenotype of drug re-sistance.Methods Using RAPD technique to genotype from clinical isolated samples from four hospitals and to analy-sis the relationship both the phenotype and drug resistance to antibiotics.Results Results of RAPD genotyping showed that RAPD in optimized condition could be used in enterococcus genotyping with the genotyping rate was100%.32strains of enterococcus were grouped into eight genotypes based on the fragments of amplified products.The most common types wereⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅶ,with accounted for81.4%.GenotypeⅠandⅧwere drug resistant toβ-lactam antibiotics,and high-level aminoglycoside antibiotics.GenotypeⅣwas drug resistant toβ-lactam antibi-otics.GenotypeⅢandⅦwere drug resistant to high-level amioglycoside antibiotics.GenotypeⅡ,ⅤandⅥwere sensitive toβ-lactam antibiotics,high-level aminoglycoside antibiotics and glycopeptide antibiotics.Conclusion The RAPD type technique was an useful genotyping method to type enterococcus stains with specificity,sensitivity,simplicity and rapidness,powerful discrimination,high typeability,good reproduction.And there was a certain relation-ship between the RAPD genotyping of enterococcus and the phenotype of drug resistance to antibiotics.
   
  【Key words】 enerococcus;random amplified polymorphic DNA;genotyping
      
  腸球菌的感染和耐藥性是目前國內外關注的重要課題和難點。美國疾病控制中心(CDC)醫院感染監測系統(NISS)調查表明,腸球菌已成為醫院感染的重要病原菌之一 [1] ,并且腸球菌的分離率不斷上升 [2]。尤其多重耐藥(MDR)腸球菌的出現,特別是高水平氨基糖苷類耐藥(HLAR)腸球菌以及耐萬古霉素腸球菌(VRE)的出現,其耐藥性和耐藥水平越來越高,成為抗感染治療的新挑戰。近年來,隨著分子生物學技術的發展,具有分辨力強、分型率高和重復性好的RAPD分型技術已應用于腸球菌的基因分型和相關研究 [3] ,并顯示出較好的應用前景。RAPD分型法是1990年內Williams和Welsh等建立的一種以PCR為基礎的提示基因同源性和基因多態性的方法,該法最大特點是可對模板序列未知,而隨機引物可以是任意的單鏈寡聚核苷酸片段。同時可通過在RAPD分型的基礎上,進行與其耐藥性關系的研究,可在基因水平上對臨床細菌的耐菌性進行測報。因此,腸球菌的基因分型鑒定對于其流行病學分析和感染控制具有重要意義。為此,我們收集臨床分離的64株腸球菌進行RAPD分型技術已應用于腸球菌的基因分型和相關研究現報告如下。

  1 材料與方法
    
  1.1 菌株 2003年1月~2004年12月本院住院患者的尿液、痰液、大便、分泌物、膽汁、前列腺液、血液等臨床標本中分離的64株腸球菌,已經系統鑒定。
   
  1.2 細菌DNA的提取 將64株腸球菌分別接種于血平板,35℃培養18~24h。用接種環將菌落分別接種于5ml的普通營養瓊脂(LB)液體培養基中,35℃恒溫搖床過夜,取1.5ml菌液離心收取菌體,酚氯仿法抽提后DNA,分光光度法測定抽提后DNA的純度,A260/A280為1.82~1.98之間,符合DNA樣品要求,置-20℃冰箱保存備用。
  
  1.3 RAPD反應體系條件的優化

  1.3.1 引物的設計 RAPD引物共6條,5條為10bp的引物,1條為9bp的引物。序列15′-GAAGTCGTLL-3′,序列25′-TCACGCTGCA-3′,序列35′-GGAGGGTGTT-3′,序列45′-AGGGAACGAG-3′,序列55′-ACGCGLCCT-3′,序列65′-GGGATGGAAC-3′。由上海生工生物工程公司提供。
   
  1.3.2 RAPD引物、Mg 2+ 濃度、Taq DNA聚合酶、循環參數的反應條件優化 在50μl PCR反應體系中含被篩選的隨機引物之一2μl(10pmol/L),10×buffer5μl dNTP0.4μl(0.2mmol/L),Mg 2+ 濃度1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mmol/L,Taq DNA溶酶1.5U、2.0U、2.5U、3.0U,DNA模板5.0μl循環參數94℃預變性3min后,再經94℃1min,35℃1min,72℃2min各35、40、45、50個循環后72℃延伸5min,取5μl擴增產物加上2μl上樣6×buffer,經1.5%瓊脂糖凝膠(內含0.5μg/ml EB染料)電泳,85~100V電泳1h,同時用DNA marker作標準,紫外分析儀下觀察并拍照,進行RAPD結果比較,觀察RAPD分型指紋圖,確定RAPD分型技術的優化條件反應體系。
   
  1.4 RAPD優化條件的基因分型實驗方法(略)
   
  循環參數為94℃預變性,再經94℃1min、35℃1min、72℃2min、45個循環后經72℃延伸5min。
   
  1.5 優化條件反應體系的重復性試驗 隨機6株不同DNA指紋的樣本在優化反應體系下重復檢測3次,觀察DNA指紋圖譜

  2 結果
    
  2.1 RAPD反應體系的優化
   
  2.1.1 隨機引物的篩選 每次RAPD分析加入6條隨機引物之一,結果顯示引物AW96628,序列3為5′-GGAGGGT-GTT-3′和引物AW96627,序列2為5′-TCACGCTGCA-3′均能對腸球菌產生特征RAPD譜型,而引物AW96628產生的RAPD指紋圖譜,擴增條帶最清晰,分辯率最高,為最佳引物,其它4條引物菌株出現RAPD指紋圖譜,條帶少,不夠清晰,沒有長、中、短片段分布。
   
  2.1.2 Mg 2+ 濃度的影響 以Mg 2+ 濃度為2.5mmol/L時擴增條帶最清楚,長短片段分布均勻,擴增效率最高。
   
  2.1.3 Taq DNA聚合酶的影響 Taq DNA聚合酶為2.5U時,擴增帶亮度最強,產物最多,若在1.5U時有些產物丟失,且擴增帶存在模糊,其它用量單位對指紋圖譜影響不大,但為便于觀察和拍照,以選用2.5U為最佳。
   
  2.1.4 循環參數的影響 以循環次數為45時,指紋圖譜最 為清晰,若為35個循環擴增產物的指紋圖譜幾乎無法辨認。
   
  2.2 RAPD分型譜 選用引物為AW96288,序列3,5′-GGAGGGTGTT-3′的優化體系反應條件下,64株腸球菌均產生特征指紋圖譜,經歸納分析發現8種類型的DNA指紋圖譜,其擴增DNA的特征片段在200~1543bp之間,各帶型間有較高的相似性,8種類型分別以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ等8個英文字母表示,其中DNA指紋中Ⅰ型占15.6%(10/64),Ⅱ型占18.8%(12/64),Ⅲ型占12.5%(8/64),Ⅶ型占25.1%(16/64),其它四型均<10%。擴增帶在4~8條間,其中分子量為697bp擴增帶頻率最大,有可能為腸球菌的特征帶。見表1、圖1。
    
  表1 64株腸球菌RAPD分型譜(略)
   
  M:DNA marker;Ⅰ-Ⅷ:8種型別腸球菌的DNA指紋
   
  圖1 腸球菌RAPD分型的8種DNA指紋(略)
    
  2.3 腸球菌RAPD分型與其耐藥性關系 RAPD分型的8種型別與β-內酰胺類、氨基糖苷類、糖肽類抗生素耐藥譜的關系顯示,Ⅰ、Ⅷ型具有對β-內酰胺類抗生素和高水平氨基糖苷類抗生素耐藥。Ⅳ型具有對β-內酰胺類抗生素耐藥。Ⅲ、Ⅶ具有對高水平氨基糖苷類抗生素耐藥。Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型具有對β-內酰胺類抗生素、高水平氨基糖苷類抗生素、糖肽類抗生素敏感。
   
  2.4 優化反應系條件的重復性 對6種不同DNA指紋的細菌樣本的優化反應體系條件下重復檢測3次,各自的RAPD指紋圖基本一致,呈現良好的穩定性。
    
  3 討論
    
  腸球菌不同菌種的耐藥性不同,腸球菌菌種、亞種甚至基因分型的鑒定對于其流行病學及感染控制具有重要意義 [4] ,腸球菌的實驗檢查至今未有明確完善的分型方法。傳統的分型方法主要有細菌素分型、噬菌體分型、生化反應類型分型、耐藥譜分型和血清學分型等。但這些方法均存在著粗糙、特異性低、不穩定、費時、費力等問題,近年來隨著分子生物學技術的發展,具有分辨力強、分型率高和重復性好的質粒分型,PFGE、RAPD、RFLP等技術已應用到腸球菌的基因分型和相關研究 [3,5] 。
     
  RAPD是一種新興的基因分型方法,可對細菌病原微生物進行基因分型并廣泛應用于分子微生物學等流行病學調查及醫院感染等分析 [6] ,RAPD分型法是1990年由Williams和Welsh等建立的一種以PCR為基礎的揭示基因同源性和基因多態性的方法,該方法的最大特點是可對模板序列未知,而隨機引物可以是任意5~20個bp的單鏈寡聚核苷酸片段。由于采用低退火溫度和隨機引物,引物的篩選成為RAPD成功分型的關鍵。此外,鎂離子濃度、Taq DNA聚合酶、循環參數等因素都會對RAPD的實驗結果產生影響 [7] 。本實驗首先對RAPD反應體系中的各種因素進行優化、標準化,建立起腸球菌的RAPD分型方法進行基因分型,該方法具有特異、敏感、簡便快速、分辨力強、分型率高和重復性好等特點,在可有效地對腸球菌做基因分型,有利于腸球菌感染分子流行病學研究和探討疾病的感染源、病原流行株的分子進化。同時還進行了腸球菌RAPD分型與其耐藥性關系的研究,可以通過RAPD分型技術在型別鑒定的基礎上,有望在基因水平上對臨床細菌的耐藥性進行測報,這在國內上尚屬創新和先進的實驗研究,本實驗研究有較大的實用價值和應用前景。
   
  本實驗經研究選用引物AW96628行RAPD,成功地對64株臨床分離鑒定的腸球菌進行分型,分型率為100%,這為腸球菌RAPD研究提供了最佳引物,有利于不同實驗室進行分型的比較,結果顯示,根據DNA產物片段大小和數目的不同,共分為8種基因型,各型的RAPD指紋圖譜不同,表現出基因多態性。每型的RAPD指紋圖譜極其相似,表現出高度同源性,特別是所有腸球菌都共有分子量約697bp片段擴增帶,這可能為腸球菌的特征帶,有待進一步研究證實。這說明腸球菌在遺傳上既有基因多態性,也存在穩定性。本實驗結果證實,本地區內RAPD分型以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ型為主,共占81.4%。
   
  由于反應體系中的關鍵反應成分有著一定的交互作用的影響 [8] ,因此反應體系的優化是RAPD研究必須進行的一項工作,只有以統一的最佳隨機引物、擴增體系中Mg 2+ 濃度、Taq DNA聚合酶、循環參數進行的RAPD,才能形成某一細菌RAPD分型的優化、標準化條件。引物低退火溫度下,引物G+C含量在擴增效率方面有重要價值 [9] ,在本實驗中,以G+C含量為60%的引物AW96628為最佳。Mg 2+ 濃度、Taq DNA多聚糖、循環參數的改變也影響著RAPD,本實驗研究證實這些影響的存在,在RAPD分型時要尤加注意。此外,模板DNA的質量也很重要,如果其制備方法有差異,其質量就可能存在差異,在這些情況,即使使用相同 的隨機引物擴增,不同方法以提取的同一種細菌DNA的RAPD指紋圖譜會有很大差異。因此,要求在相同條件下制備細菌DNA。本實驗細菌DNA的提取質量很好地保證了DNA的純度。
   
  細菌耐藥表型與其基因型有密切的關系,變異機制有多種,但最重要的是基因突變,這在RAPD分型方法中可反應在DNA擴增帶型的改變,如果某一基因型與某一特定的表型之間有相關,那么就可以直接通過檢測該基因型來確定與之相對應的表型。Willems [9] 和Delvecchio [10,11] 等用分子生物學技術研究了腸球菌基因型和抗生素耐藥基因。本實驗應用RAPD分型對標本進行耐藥表型分析,研究了腸球菌基因型和其耐藥表型之間的關系。實驗結果顯示,Ⅰ、Ⅳ、Ⅷ具有對β-內酰胺類抗生素耐藥表型,Ⅲ、Ⅶ型具有對高水平氨基糖苷類抗生素耐藥表型,Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ具有對β-內酰胺類抗生素、高水平氨基糖苷類抗生素、糖肽類抗生素等抗生素敏感表型。基因型與其耐藥菌性之間關系,有何影響,國內外尚無報道,有待進一步探討。這一結果提示,腸球菌的臨床分離菌株,在通過RAPD分型的基礎上結合其耐藥表型,有望在基因水平上對腸球菌的耐藥性進行測報。
   
  本實驗可能由于研究收集的腸球菌本身的特性或研究菌株較少,如將在今后工作中能深入研究,相信RAPD分型技術必會對腸球菌的控制和防治工作發揮積極的作用。

  【參考文獻】
    
  1 Tomayko JF,Murray BE.Analysis of enterococcus faecalis isolates from intercontinental sources by multilocus puzyme electophoresis and pulse-field gel electrophoresis.J Clin Microbiol,1995,33(11):2903-2907.

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  9 Willems RJ,Top J,Vanden BN,et al.Molecular diversity and evalution-ary relationships of Tn1546-like ellments in Enterococci from humans and animals.J Antimicrb Agents Chemother,1999,43:483-491.
   
  10 Delvecchio VG.Rapid detection of Enterococci and antihiotil resistanc genes in urine:Approaching realtime capability.J Clin Microbiol Neusl,1998,20:192-195.
   
  11 Setting of endmicity in an inteasive car unit.J Clin Microbiol,1997, 37:3654-3661.

  (編輯李 弋)

  作者單位:425000湖南省永州市人民醫院檢驗


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