當前位置:Home > 醫源資料庫 > 在線期刊 > 中華醫學研究雜志 > 2005年第5卷第8期 > IgY技術及其在醫學領域的應用

IgY技術及其在醫學領域的應用

來源:中華醫學研究雜志 作者:王婷宋懷燕 2006-8-19

摘要: 【摘要】 隨著對卵黃免疫球蛋白(IgY)研究的逐步深入,卵黃抗體技術(IgY技術)正在成為生物技術領域和醫藥研究中的新熱點,由于IgY化學性質穩定,產量高、成本低,以及動物種系發生學距離的優勢,更適于生產特異性抗體,具有開發功能性食品和新藥的潛能。 【關鍵詞】 IgY技術。卵黃抗體。臨床應用與產生于哺乳動物的Ig......


  【摘要】  隨著對卵黃免疫球蛋白(IgY)研究的逐步深入,卵黃抗體技術(IgY技術)正在成為生物技術領域和醫藥研究中的新熱點,由于IgY化學性質穩定,產量高、成本低,以及動物種系發生學距離的優勢,更適于生產特異性抗體,具有開發功能性食品和新藥的潛能。      

  【關鍵詞】  IgY技術;卵黃抗體;臨床應用

  與產生于哺乳動物的IgG相比,IgY具有許多獨特的優點:(1)無需采血,只需收集免疫母雞產下的雞蛋即可獲得抗體;(2)使用少量的抗原免疫禽類既可獲得大量的質量均一的特異性IgY;(3)由于種系發生距離相差很大,禽類IgY與哺乳動物免疫球蛋白之間不會發生交叉血清學反應;(4)不激活哺乳動物的補體系統,不與類風濕因子或Fc受體相結合,避免在免疫檢測過程中產生假陰性或價陽性結果;(5)耐熱、耐酸,巴氏滅菌溫度下也不會失活并且在pH值小于3時仍能保持穩定活性 [1] 。   

  20世紀80年代以來IgY抗體開始廣泛應用,Dr.C.Staak在1995年首先使用IgY技術這一術語。1996年,IgY抗體的生產和應用被定義為IgY技術 [2] 。如今,它已是一個世界性的標準化技術。1996年,歐洲實驗方法替換確認中心(European Centre for the Validation of Alternative Method,ECVAM)推薦使用IgY來替代哺乳動物IgG,以減少由于抗體采集而造成對動物的傷害,該中心還提供有關實驗雞飼養、雞免疫獲得辦法、免疫佐劑應用、IgY提純和儲存辦法等方面的信息 [3] 。1999年,基于對動物權益的保護,IgY技術被瑞士聯邦政府獸醫辦公室接受為可行的替代辦法。不斷增長的文獻數目顯示,IgY技術正成為醫藥領域的新熱點。   

  由于卵黃抗體(IgY)化學性質穩定,產量高、成本低,以及動物種系發生學距離的優勢,更適于生產特異性抗體,其被動免疫功能可以用于抗病毒和細菌性疾病,具有開發功能性食品和新藥的潛能,用特異性IgY治療腹瀉等胃腸道疾病已經在獸醫學中獲得應用,許多治療人腹瀉方面的臨床前和臨床研究正在開展中 [4,5] 。目前國內IgY技術的研究和應用主要在獸醫和功能食品方面,在醫藥方面的基礎工作還比較薄弱。隨著IgY技術在南美等發展中國家和地區的迅速推廣和成功應用及國內多項相關研究工作的開展,這一技術預計將得到迅速發展 [6] 。

  1 卵黃抗體的提取與純化卵黃作為特異性抗體IgY的來源有許多優點:母雞易于飼養,費用不高;收集雞蛋方便,無需抽動物血,無損傷,符合現代動物保護原則;產生有效免疫反應所需抗原量小,尤其是高度保守的哺乳動物蛋白質對種系發生學上距離較遠的禽類通常有較強的免疫原性。Carroll和Stollar [7] 僅用總量30~475μg的增殖細胞核抗原,成功地產生雞抗弱免疫原性RNA多聚酶Ⅱ的抗體。Gottestein和Hemmeler [8] 的實驗表明,在1個月內收集的提純IgY產量比兔血清高18倍。Gassmann等用20~30μg增殖細胞核抗原初次免疫20天后出現特異IgY抗體,30天達高峰,并持續81天以上。卵黃中無其它Ig類,使得IgY易于提純等。此外,某些病原微生物如輪狀病毒,衣原體等可在雞胚中增殖。用這些感染的雞胚組織為抗原免疫雞獲取相應抗體時,可省去抗原提純的復雜過程。臺灣學者蘇和平等以酸、堿、酒精、食鹽及加熱等五種加工條件處理市售雞蛋,結果顯示室溫下以酸(pH值2.73)處理殼蛋48h,蛋黃中IgY已喪失99%;堿(4.2%w/v氫氧化鈉)處理14天或飽和食鹽水處理28天,可保留蛋黃中IgY24%~33%;而以酒精(16%v/v)處理4天或加熱處理成溏心蛋,則可保留47%以上。另以不同加熱條件處理免疫雞蛋,顯示在使蛋黃中心溫度低于70℃下加熱,依加熱時間的長短,蛋黃中IgY可保存21%~81%。   

  在國內,雞是率先實現SPF化和產業化的實驗動物,有利于規模化生產;禽類與以人為代表的哺乳動物親緣關系較遠,有利于疾病控制,用雞生產人用的免疫球蛋白,不會將導致人類疾病的病原微生物引入到病人的體內,可以解決治療上的后顧之憂。   

  卵黃中的主要成分是蛋白質和脂肪,其比例為1:2。大部分蛋白質都是脂蛋白質,存在于卵黃顆粒中,不溶于水,只有卵黃球蛋白(α、β、γ)是水溶性的,而IgY是γ卵黃球蛋白。因此IgY的分離純化首先需有效地去除卵黃中的脂類,從水溶性蛋白中分離IgY。近十幾年來,已建立了許多較為高效而經濟的方法。這些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、自然膠,如藻酸鈉、角叉菜膠 [9] 或乙醇沉淀等方法初步純化蛋白質,產量約為每ml卵黃提取IgY5~7.5mg,純度87%~89%。   

  1980年,Polson首先提出聚乙二醇(PEG)兩步沉淀法,分別用終濃度為3.5%和12%的PEG分步沉淀,用硫酸銨鹽析法去除PEG [10] 。1985年,在此基礎上提出了冷乙醇沉淀的改良方法,使產量提高,而且能有效地去除殘留PEG。1981年,Jensensius等提出了硫酸葡聚糖沉淀法(DS法)。Bade和Stegemann(1984)用預冷的丙烷和丙酮(-20℃)沉淀蛋白質并去除脂質,經DEAE柱層析進一步純化,方法簡便、省時。其IgY抗體活性與用Polson法提純的IgY之間無明顯差別。且穩定性好,經3次以上凍融,抗體活性未見改變。此實驗中以PEG代替硫酸鹽沉淀,可進一步提高產量。Akita等在此基礎上建立了水稀釋法(WD法)。即以9份水稀釋1份卵黃,離心去除顆粒,再用硫酸鹽沉淀法濃縮,并經超濾或乙醇沉淀或鹽沉淀進一步純化、濃縮,再經凝膠過濾提純,產量達9.8mg IgY/ml卵黃,純度94% [11] 。此后,Akita等比較了WD法、PEG法、DS法和黃原膠法的提純效果,結果表明WD法產量最高,其次為DS法,WD法更適合大規模生產。   

  IgY的進一步提純可用提純其它蛋白質的方法。常見的有凝膠過濾、DEAE纖維素陰離子交換柱層析和親和層析等方法。必須指出,許多動物IgG均可用蛋白A親和分離。但IgY不能與蛋白A結合。McCannel和Nakai [12] 用DEAE離子交換層析分離IgY亞群。在提高磷酸鹽離子濃度的同時,始終維持一定的pH值。固相金屬離子親和層析是一種蛋白質純化技術。最常用的金屬離子有Cu 2+ 、Ni 2+ ,Co 2- 、Zn 2+ 。研究表明Fe 3+ 離子與磷酸化氨基酸有很強的親和力。結合于離子柱上的蛋白質常通過降低pH值或提高鹽濃度或二者合并進行洗脫。Greene和Holt用固相金屬離子(Fe 3+ )親和層析,通過改變pH值梯度,根據4個洗脫峰將IgY分為4個亞群。Bizhanov比較了氯仿、萄聚糖藍(dextranblue,DB)和PEG三種提取IgY的方法,前者IgY產量比后二種方法高2~4倍;用SDS-PAGE分析其相應產物,發現DB法提純獲得三種主要的蛋白成分:34.7KDa、41KDa和66KDa,并含少量45KDa成分;氯仿法提取主要含兩種蛋白成分:45.7KDa或75.2KDa;而用PEG提取獲得以66KDa為主的蛋白成分,氯仿及PEG法提取的蛋白質中也包含少量41-80KDa的IgY [12] 。

   2 IgY抗體在醫學方面的應用    

  2.1 IgY在人類疾病診斷中的應用 隨著實驗室和臨床研究對抗體需求的增加,廉價大規模抗體制備技術已成為新的研究課題。利用超免疫雞將特異性抗體穩定持續地傳至卵黃中,制備特異性多克隆抗體,成本低且產量高,有望成為規模制備特異性抗體的有效手段。由于IgY的許多優點,其在免疫學檢測診斷方面正越來越被廣泛應用。致病性大腸桿菌(enteropathogenic escherichia coli,EPEC)是引起嬰幼兒腹瀉的常見病原體,而菌毛中的結構重復蛋白A亞單位(structural repeating protein A subunit,BfpA)是EPEC發病機制中的主要致病因子,制備BfpA的IgY可以篩選人排泄物標本中EPEC的存在。2003年,De-Almeida CM [13] 等制備了抗BfpA的IgY用于免疫吸附,發現IgY可以特異性地 鑒定EPEC。   

  蔭俊等采用MA-104細胞轉瓶培養技術,制備人型輪狀病毒Wa和猴型輪狀病毒SA11,以純化病毒+佐劑對SPF純系萊航產蛋母雞進行強化免疫,通過鹽析、柱層析和超濾方法從卵黃中制備特異性免疫球蛋白,結果表明,免疫雞卵黃中產生高滴度特異性抗輪狀病毒免疫球蛋白,其ELISA免疫效價達1.5×10 5 ,在定期加強免疫條件下,卵黃抗體效價維持在高滴度可達12個月以上。經脫脂鹽析和層析純化的IgY抗體,在4℃條件下其免疫效價可穩定保存6個月以上。體外細胞病變抑制實驗結果表明,批量制備的IgY抗體具有高效價的特異性輪狀病毒中和活性 [5] ,可用于常規實驗室和其他醫學實驗。   

  2.2 IgY對檢測方法的改進 膠乳凝集試驗是將可溶性抗原(或抗體)吸附于聚苯乙烯膠乳載體顆粒的間接凝集試驗。根據此原理,將膠體金標記抗體固定于特制的載體,則為免疫金標記法。這種方法簡便、快速、敏感、特異,因此廣泛用于疾病的快速診斷。試驗中常用的抗體是哺乳動物IgG。然而,聚苯乙烯膠乳吸附蛋白質存在結合不牢固的問題,影響了檢測效果。由于IgY具有更高的特異性和敏感性,可用IgY代替哺乳動物抗體作膠乳凝集試驗及制作膠體金。Davalos Pantoja L [14] 等對此做了初步研究。他們對IgY膠乳復合物進行了蛋白質吸附和解離、等電點、電場遷移率和膠體金穩定性等研究,并與IgG進行比較,發現IgY是一種疏水性更強的蛋白質,它與乳膠的結合力更強,用它包被乳膠顆粒制作的膠體金比IgG穩定性更好。   

  由于IgY本身具有良好的穩定性,用于親和層析柱純化制備所需蛋白,可以反復使用,提高了親和層析法分離蛋白的效率,這使IgY用于疾病的相關性蛋白的檢測更快速、價廉。Akita EM [15] 等用IgY制備的親和層析柱分離乳清和初乳中的IgG,一年多的時間內使用了50多次,其結合力只略有下降,說明用IgY制備的親和層析柱相當穩定。2.3 IgY在人類疾病防治中的應用   

  2.3.1 抗細菌感染 幽門螺旋桿菌(Helicobacter.Pylori,Hp)是引起慢性胃炎和消化性潰瘍等胃腸疾病的病原菌,感染率極高。也是世界衛生組織認定的胃癌致病因子,在潰瘍患者中Hp的感染率為80%,健康人群為60%,60歲以上人群為70%,胃癌、胃潰瘍均屬消化道疾病。Weeks等(2000)發現,位于Hp細胞膜表面存在一種專門負責調節胞質內尿酶產生的蛋白質-Urel,Urel起“質子通道”作用,可控制進入細胞的胃酸量。研究表明,含抗Hp特異性IgY的高免蛋黃可破壞Urel,使菌體失去酶保護膜,無法在胃中強酸環境下存活,從而有效消滅Hp。   

  沙門氏菌是腸道感染的常見病原菌,Lee EN [16] 等在體外實驗中發現,特異性抗沙門氏菌的IgY能有效防治人類沙門氏菌性腸炎。   

  變形鏈球菌被公認是引起齲齒最主要的病原菌。Smith DJ [17] 等用變形鏈球菌葡萄糖結合蛋白B(glucan-binding protein B,GBP-B)免疫雞獲得特異性抗GBP-B的IgY,研究發現該IgY可以預防變形鏈球菌引起的齲齒。美國已于1999年首先生產出了抗齲病IgY產品(健齒露),目前已通過我國生物制劑的安全評價,進入我國市場。   

  陰道加特納桿菌是引起婦科疾癥的主要致病菌,林元藻等用加特納桿菌作為抗原免疫Leghon雞,得到高純度特異性IgY,具有良好的生物學活性 [18] 。  

  2.3.2 抗病毒感染 輪狀病毒是引起秋冬季嬰幼兒腹瀉的主要病原體之一,目前尚無有效的疫苗。蔭俊(2000)、郭立君等(2001) [4,5] 分別對抗輪狀病毒IgY的研制及生物學活性等方面進行了研究。目前抗輪狀病毒IgY(如百貝寧)是我國已商品化的治療和預防該病的生物制品。聶榮慶等對抗SARS-CoV雞卵黃免疫球蛋白進行了研究 [19] 。   

  乙型肝炎是一種全世界廣泛流行的傳染病,每年全球有約25萬人死于與乙肝有關的肝病。乙肝表面抗體是預防乙肝病毒感染的保護性抗體,采用乙肝表面抗體陽性人血液制備成乙肝免疫球蛋白(注射)可中和入侵的病毒,使新生兒免受感染,機體迅速獲得被動性保護免疫,但人血中提取的乙肝免疫球蛋白價格昂貴。研究表明,乙肝卵黃抗體與目前商品化的人血提取抗體有很多相同的生物活性和理化性質,如能高效研究出廉價的乙肝蛋黃抗體,則市場前景廣闊。   

  2.3.3 抗腫瘤治療 Hensel T [14] 等制備了雞抗金屬蛋白酶的IgY。在小鼠體外試驗中,這種抗體可中和金屬蛋白酶的蛋白分解活性,特異地抑制C6膠質瘤細胞在視神經外植體中的擴散和浸潤。這為神經系統腫瘤的治療開辟了前景。近年來,IgY還作為藥物載體用于胃腸道癌癥的治療。Yang J [15] 等從人胃癌MGC-803細胞中提取P110蛋白作抗原免疫雞,制備了抗胃癌蛋白P110的IgY,將之作為運送抗癌藥物的載體,發現該抗體能特異地識別胃腸系統的癌組織,這為胃腸系統癌癥的治療開辟了一條新的途徑,也為其他腫瘤的治療提供了新思路。   

  2.3.4 功能性食品 IgY可作為嬰幼兒食品或中、老年人的保健食品添加劑,提高人體對各種疾病的抵抗力。美國食品和藥品管理局(FDA)認為,卵黃免疫球蛋白作為食品比作為藥物更有利,并將其列入“一般公認安全物質(Gen-erally Accepted as Safe,GRAS)”范疇,因此,如同每日飲用牛奶一樣,消費者可放心食用卵黃抗體。   

  Chae等(2000)研究了利用產蛋母雞生產抗大腸桿菌O157:H7對抗體的方法,并已取得專利。分離大腸桿菌O157:H7,于90℃滅活5~10min,制成抗原免疫母雞,獲得抗大腸桿菌O157:H7的IgY。含抗大腸桿菌O157:H7的全蛋可直接應用于食品,亦可從雞蛋中分離卵黃,凍干制成粉末,添加到待加工的糧食中。王忠澤等(2002)采用大腸桿菌O157:H7933菌株免疫SPF萊杭雞,制備抗O157:H7特異性IgY,動物被動保護實驗結果表明,口服IgY對乳鼠腸道感染模型具有明顯的保護作用;動物毒性實驗表明,口服抗體安全可靠,無毒性作用。   

  2.3.5 其他 在器官移植中,患者接受移植物后是否產生異種排斥反應是影響移植成功與否的最重要因素。補體抑制是一種有效的防止超急性排斥反應的策略。但這種方法又會引起一種急性血管異種移植排斥反應(acute vascular xenograft rejection,AVXR)。相關模型的大量證據顯示,這個過程是抗體介導的與異種移植物內皮發生相互作用的結果。因為單核細胞、自然殺傷細胞、中性粒細胞和血小板有Fc受體和C1q受體,可與結合在內皮細胞上的哺乳動物抗體相互作用,促進AVXR的發生。而IgY不與人的Fc受體   

  結合,也不與C1q受體結合而激活補體,因此可以用于 AVXR的防治。有研究者制備了雞抗豬大動脈內皮細胞的IgY,結果顯示IgY可阻斷或限制AVXR發生。因此,IgY用于器官移植可能為提高其成功率帶來新希望。

  【參考文獻】    

  1 王炯,龔春梅,趙樹棟,等.雞卵抗體(IgY)理化特性的研究.中國生物制品學雜志,1997,10(3):140-143.   

  2 Schade R,Hlinak A.Egg yolk antibodies,state of the art and futureprospects.ALTEX,1996,13(Suppl):5-9.   

  3 Schade R,Staak C,Hendriksen C et al.The production of avian(egg yolk)antibodies:IgY.The report and recommendations of ECVAMworkshop21.ATLA,1997,24(6):925-934.   

  4 郭立君,李春暉,趙鋒,等.抗輪狀病毒IgY的研制.中國生物制品學雜志,2001,14(1):24-26.   

  5 蔭俊,侯曉軍,張松樂,等.抗輪狀病毒卵黃免疫球蛋白制備工藝及生物學活性研究.解放軍藥學學報,2000,16(2):59-61.

  6 Rüdiger.Schade.張小鶯,鄭禮.IgY技術及其醫藥應用:理論基礎.中國藥理學通報,2004,20(5):491-495.   

  7 Carroll SB,Stollar BD.Antibodies to calf thymus RNA polymeraseⅡfrom egg yolk of immunized hens.J Biol Chem,1983,258:24-28.   

  8 Gottstein B,Hemmeler E.Egg yolk immunoglobulin Y as an attemative antibody in serology of echinococcosis.Z Parasitenkd,1985,71:273-276.   

  9 McCannel AA,Nakai S,Separation of egg yolk immunolobulins:a two step procedure using hydrophobic interaction chromatography and gel fil-tration.J Immunol Methods,1988,110:225-228.   

  10 Polson A,Coetzer T,Kruger J,et al.Isolation of viral IgG antibodies fromyolk of immunized hens.Immunol Commun,1980,9(6):475-478.   

 11 Akita EM,Nakai S.Immunoglobulins from egg yolks:Isolation andpurification.Journal of Food Science,1992,57:629-634.   

  12 Bizhanov G,Vyshniauskis G.A comparison of three methods for ex-tracting IgY from the egg yolk of hens immunized with Sendai virus.Vet Res Commun,2000,24(2):103-113.   

  13 De-Almeida CM,Quintana-Flores VM,Medina-Acosta E et al.Egg yolk anti-BfpA antibodies as a tool for recognizing and identifying enteropathogenic Escherichia coli.Scand J Immunol,2003,57(6):573-582.   

  14 Hensel T,Amberger VR,Schwab ME.A metalloprotease activity fromC6glioma cells inactivates the myelin-associated neurite growth in-hibitors and can be neutralized by antibodies.Br J Cancer,1998,78(12):1564-1572.   

  15 Yang J,Jin Z,Yu Q,et al.,The selective recognition of antibody IgY for digestive system cancers.Chin J Biotechnol,1997,13(2):85-90.

  16 Lee EN,Sunwoo HH,Menninen K,et al.In vitro studies of chicken egg yolk antibody(IgY)against Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium.Poult Sci,2002,81(5):632-641.   

  17 Smith DJ,King WF,Godiska R.Passive transfer of immunoglobulin Y antibody to Streptococcus mutans glucan binding protein B can confer protection against experimental dental caries.Infect Immun,2001,69(5):3135-3142.   

  18 林元藻,黃清松,李春梅,等.抗加特納桿菌卵黃免疫球蛋白(IgY)的研究.廣東藥學院學報,2004,20(5):517-519.   

  19 聶榮慶,胡國柱,張進,等.抗SARS-CoV雞卵黃免疫球蛋白的制備.中國生物制品學雜志,2004,17(6):398-399.    

  作者單位:100021北京,中國醫學科學院實驗動物研究所(Δ 通訊作者)

  (編輯:秋 實)


醫學百科App—醫學基礎知識學習工具


頁:
返回頂部】【打印本文】【放入收藏夾】【收藏到新浪】【發布評論



察看關于《IgY技術及其在醫學領域的應用》的討論


關閉

網站地圖 | RSS訂閱 | 圖文 | 版權說明 | 友情鏈接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 醫源世界 版權所有
醫源世界所刊載之內容一般僅用于教育目的。您從醫源世界獲取的信息不得直接用于診斷、治療疾病或應對您的健康問題。如果您懷疑自己有健康問題,請直接咨詢您的保健醫生。醫源世界、作者、編輯都將不負任何責任和義務。
本站內容來源于網絡,轉載僅為傳播信息促進醫藥行業發展,如果我們的行為侵犯了您的權益,請及時與我們聯系我們將在收到通知后妥善處理該部分內容