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殼寡糖抗腫瘤作用及免疫調節機理的研究

來源:中華醫學研究雜志 作者:吳海明華曉陽何登全 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 研究殼寡糖對小鼠腫瘤生長和轉移的抑制作用以及殼寡糖對培養的巨噬細胞相關的細胞因子表達的影響。 方法 接種腫瘤的小鼠尾靜脈注射殼寡糖,觀察殼寡糖對腫瘤的生長和抑制作用。用相對定量的逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術和酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測殼寡糖對巨噬細胞相關細胞因子轉錄和翻譯水平的......


  【摘要】 目的  研究殼寡糖對小鼠腫瘤生長和轉移的抑制作用以及殼寡糖對培養的巨噬細胞相關的細胞因子表達的影響。 方法  接種腫瘤的小鼠尾靜脈注射殼寡糖,觀察殼寡糖對腫瘤的生長和抑制作用。用相對定量的逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術和酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測殼寡糖對巨噬細胞相關細胞因子轉錄和翻譯水平的影響。 結果  殼寡糖對S180肉瘤的抑瘤率為35.02%(P<0.001),對Lewis肺癌的轉移灶的影響:實驗組(2.1±1.73),對照組(4.0±2.14),兩組比較,P<0.05。巨噬細胞加入殼寡糖作用24h后,細胞因子的表達明顯增強(P<0.01)。 結論  殼寡糖具有良好抑制腫瘤生長和轉移的作用。殼寡糖可增強巨噬細胞相關的細胞因子表達。    

  【關鍵詞】  殼寡糖;腫瘤;巨噬細胞;細胞因子

  Mechanism of anti-tumor and immune regulation of oligochitosan     

  WU Hai-ming,HUAXiao-yang,HE Deng-quan.

  Department of General Surgery,Traditional Chinese Medicine Hospital of Yiwu,Yiwu322000,China   

  【Abstract】 Objective To study the influence of oligochitosan in inhibiting growth and metastasis of tumor in rats,and in expression of cytokines associated with macrophage.Methods Inhibition of growth of tumor was observed after oligochitosan injected into rats through tail vein,the influence in transcription and translation of cytokines associated with macrophage was measured by RT-PCR and ELISA techniques.Results Inhibition rate of sarcoma S180was35.02%(P<0.001)after injection of oligochitosan.The influence in metastasis of Lewis lung cancer(P<0.05):experiment group(2.1±1.73),controlled group(4.0±2.14).24hs after oligochitosan added to macrophage,expres-sion of cytokine increased significantly(P<0.01).Conclusion Oligochitosan can inhibit growth and metastasis of tumor,and enhance expression of cytokines associated with macrophage.   

  【Key words】 oligochitosan;tumor;macrophage;cytokine      

  甲殼素是自然界豐富的生物資源之一,其部分脫乙酰化產物殼聚糖,具有抗腫瘤、免疫調節、抑菌等多種生理功能。但殼聚糖不溶于水,利用纖維素酶將其降解為殼寡糖,具有較好的水溶性易被人體吸收,本實驗旨在研究殼寡糖對實驗性小鼠S180腫瘤和Lewis肺癌的抑制作用以及殼寡糖對體外培養的巨噬細胞相關的細胞因子基因表達的影響。    

  1 材料與方法

  1.1 材料   

  1.1.1 殼寡糖 由浙大醫學院分子生物學實驗室制備。1.1.2 動物來源 小鼠由浙江大學醫學院動物中心提供,體重為18~20g。   

  1.1.3 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 由中科院上海細胞所提供。   

  1.1.4 標準DNA marker和ELISA實驗試劑 由上海貝西科技公司提供。1.2 方法   

  1.2.1 殼寡糖抗腫瘤作用實驗方法 無菌取S180肉瘤和Lewis肺癌細胞,制成2×10 7 細胞/ml的細胞懸液;皮下注射腫瘤液于ICR種小鼠(0.2ml/只),次日分組進行實驗,每 組10只ICR種小鼠。實驗組尾靜脈注射100mg/kg的殼寡糖,對照組注射生理鹽水,停藥次日處死小鼠,剝離實體瘤稱重或觀察轉移病灶數,計算抑瘤率(%)。   

  1.2.2 殼寡糖對巨噬細胞相關細胞因子表達的影響實驗方法 培養小鼠采用RT-PCR法和ELISA法研究殼寡糖對巨噬細胞IL-1、TNF-a和IL-18的基因表達的影響:實驗組和對照組巨噬細胞→分別提取RNA和收集上清液→RT-PCR法檢測mRNA水平基因表達的變化以及ELISA法檢測蛋白表達量的變化。   

  1.3 統計學方法 各組值均采用均數±標準差(ˉx±s)表示,組間采用t檢驗,P<0.05為統計學差異有顯著性意義。    

  2 結果    

  2.1 殼寡糖抗腫瘤作用 殼寡糖對小鼠S180肉瘤生長的影響(見表1),從表中可以看出實驗組的抑瘤率為35.02%(P<0.001),環磷酰胺組的抑瘤率為50.16%(P<0.001)。殼寡糖對Lewis肺癌的影響(見表2)實驗組的轉移灶為(2.1±1.73),對照組的轉移灶為(4.0±2.14),P<0.05。綜合表1和表2可以看出殼寡糖對腫瘤的生長和轉移具有明顯的抑制作用。

  表1 殼寡糖對小鼠S180肉瘤生長的影響 (略)

  表2 殼寡糖對小鼠Lewis肺癌轉移的影響(略)

  2.2 殼寡糖對巨噬細胞相關細胞因子表達的影響  

  2.2.1 殼寡糖最適作用時間的確定 巨噬細胞貼壁后加入殼寡糖,在4、8、16、24、48h不同時間段通過RT-PCR法檢測IL-1β、INF-α、IL-18的基因轉錄水平,結果顯示24h達到高峰,故確定以24h為殼寡糖最適作用時間。    

  2.2.2 殼寡糖最適作用濃度的確定 小鼠巨噬細胞經培養貼壁后,按濃度10、20、30、40、60、80μg/ml的劑量加入殼寡糖繼續培養,各組巨噬細胞樣本經RT-PCR法結果見表3、4、5。    

  表3 不同濃度殼寡糖對巨噬細胞IL-1β基因轉錄水平的影響(略)

  注:以β-actin為內參照標準,各組均值以均數±標準差表示; * 表示經t檢驗與對照組差異有顯著性,P<0.05(n=4)

   表4 不同濃度殼寡糖對巨噬細胞IL-18基因轉錄水平的影響(略)

  注:以β-actin為內參照標準,各組均值以均數±標準差表示; ◆ 表示經t檢驗與對照組差異有顯著性,P<0.05, * 表示經t檢驗與對照組差異有顯著性,P<0.01(n=4)     表5 不同濃度殼寡糖對巨噬細胞TNF-α基因轉錄水平的影響(略)

  注:以β-actin為內參照標準,各組均值以均數±標準差表示; * 表示經t檢驗與對照組差異有顯著性,P<0.05(n=4)  

  結果顯示10μg/ml的殼寡糖實驗組與對照組比較無顯著性差異,20、30及40μg/ml組均差異有顯著性,故確定20μg/ml的殼寡糖為對IL-1β和TNF-α的最適作用濃度,以40μg/ml的殼寡糖作為對IL-18的最適作用濃度。   

  2.2.3 20μg/ml的殼寡糖對IL-1β和TNF-α的轉錄和翻譯水平的影響用含20μg/ml殼寡糖刺激培養的巨噬細胞,用RT-PCR法檢測殼寡糖對IL-1β和TNF-α轉錄的水平的影響,用EISA法檢測殼寡糖對IL-1β和TNF-α分泌的影響(見表6、7、8、9)。   

  2.2.4 40μg/ml殼寡糖對IL-18基因轉錄水平和翻譯水平的影響 用含40μg/ml殼寡糖的細胞培養液培養巨噬細胞,RT-PCR檢測對IL-18基因轉錄水平的影響ELISA法檢測對IL-18細胞因子分泌的影響(見表10、11)。    

  表6 20μg/ml殼寡糖對IL-1β基因轉錄水平的影響(略)

  注:以β-actin為內參照標準,均值以均數±標準差表示; * 表示經t檢驗與對照組差異有顯著性,P<0.01    

  表7 20μg/ml殼寡糖對巨噬細胞釋放IL-1β的影響(略)

  注:均值以均數±標準差表示; * 表示經t檢驗與對照組差異有顯著性,P<0.01 

  表8 20μg/ml殼寡糖對TNF-α基因轉錄水平的影響(略)

  注:以β-actin為內參照標準;均值以均數±標準差表示; * 表示經t檢驗與對照組差異有顯著性,P<0.01    

  表9 20μg/ml殼寡糖對巨噬細胞釋放TNF-α的影響(略)

  注:均值以均數±標準差表示; * 表示經t檢驗與對照組差異有顯著性,P<0.01    

  表10 40μg/ml殼寡糖對IL-18基因轉錄水平的影響(略)

  注:以β-actin為內參照標準,各組均值以均數±標準差表示; * 表示經t檢驗與對照組差異有顯著性,P<0.01

  表11 40μg/ml殼寡糖作用下IL-18ELISA檢測結果(略)

  注:各組均值以均數±標準差表示; * 表示經t檢驗與對照組差異有顯著性,P<0.01      

  結合RT-PCR和ELISA實驗結果,可以看出殼寡糖能促進巨噬細胞細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18基因表達,促進巨噬細胞分泌細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18。

  3 討論   

   國內外研究發現殼寡糖具有多種優異的生理功能,能提高機體的抗腫瘤能力和免疫功能 [1~3] 。實驗結果表明,以殼六糖為主的殼寡糖具有良好的抑制腫瘤細胞生長和抑制腫瘤轉移的作用。殼寡糖對S180肉瘤的抑制作用較環磷酰胺略弱,但兩者與對照組比較差異均有非常顯著性(P<0.001)。殼寡糖對Lewis肺癌轉移的抑制作用較干擾素略強,轉移灶數分別為殼寡糖組(2.1±1.73)和干擾素組(2.8±1.39),兩組與對照組比較差異均有顯著性(P<0.05)。   

  現代腫瘤免疫學研究發現巨噬細胞、T淋巴細胞和NK 細胞在抗腫瘤的免疫效應中發揮著主要作用。巨噬細胞在免疫系統中具有十分重要的地位,它屬于專職的抗原提呈細胞(APC),同時又是免疫效應細胞,它通過吞噬提呈抗原、激活T淋巴細胞,并分泌和產生多種細胞因子、活性氧及一氧化氮(NO)等,誘導腫瘤細胞凋亡及抑制蛋白質合成等作用,是機體免疫應答和免疫調節的重要環節 [4] 。實驗結果顯示殼寡糖能促進巨噬細胞細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18基因的表達,促進巨噬細胞分泌細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18。而這些細胞因子又可以反饋激活巨噬細胞和NK細胞,形成網絡狀的反饋調節關系,從而極大地增強機體的免疫功能和抗腫瘤能力。   

  殼聚糖是自然界中第二大生物資源,其降解產物殼寡糖具有無毒、無免疫源性、良好的組織相容性和易溶于水、生物活性高等特點 [5] ,可開發成為一種新型的抗腫瘤藥物和免疫調節劑。 

  【參考文獻】    

  1 張虎,杜昱光,虞星炬.幾丁寡糖與殼寡糖的制備和功能.中國    生化藥物雜志,1999,20(2):99.   

  2 杜昱光,白雪芳,金宗濂,等.殼寡糖抑制腫瘤作用的研究.中國    海洋藥物,2002,21(2):18-21.   

  3 Ouchi T,Banba T,Matsumoto T,et al.Synthesis and antitumor activ-ity of conjugates of5-fluorouracil and chito-oligosaccharides involv-ing a hexamethylene spacer group and carbamoyl bonds.Drug Des De-liv,1990,6(4):281-287.   

  4 竺國芳,趙魯杭.幾丁寡糖和可寡糖的研究進展.中國海洋藥    物,2000,19(1):43-46.   

  5 Kim SK,Park PJ,Yang HP,et al.Subacute toxicity of chitosan oligo-saccharide in Sprague-Dawley rats.Arzneimittelforsch,2001,51(9):769-774.

  (編輯:李 弋)


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