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枸杞多糖誘導雄激素不依賴型人前列腺癌細胞凋亡及相關基因表達的研究

來源:中華醫學研究雜志 作者:李卓能,羅瓊 ,楊明亮,閆俊,龐雅琴,姜鳴 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 目的 研究枸杞多糖對誘導人前列腺癌PC-3細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2和Bax表達的影響。 方法 體外培養的人前列腺癌PC-3細胞經枸杞多糖作用后,采用MTT法測定細胞的增殖情況。采用TUNEL觀察PC-3細胞凋亡的變化,用免疫組化法檢測其Bcl-2和Bax蛋白的表達。 結果 一定劑量的枸杞多糖可明顯抑制PC-3細胞的生長,并能誘導......


  【摘要】 目的  研究枸杞多糖對誘導人前列腺癌PC-3細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2和Bax表達的影響。 方法  體外培養的人前列腺癌PC-3細胞經枸杞多糖作用后,采用MTT法測定細胞的增殖情況。采用TUNEL觀察PC-3細胞凋亡的變化,用免疫組化法檢測其Bcl-2和Bax蛋白的表達。 結果  一定劑量的枸杞多糖可明顯抑制PC-3細胞的生長,并能誘導人前列腺癌PC-3細胞凋亡,凋亡率為41.5%,同時PC-3細胞Bcl-2/Bax蛋白比值顯著下降,呈明顯的劑量/效應關系。 結論  枸杞多糖能誘導人前列腺癌PC-3細胞的凋亡,其機制與調節人前列腺癌PC-3細胞Bcl-2和Bax蛋白表達有關。

  【關鍵詞】  枸杞多糖;人前列腺癌細胞;細胞凋亡;Bcl-2;Bax
     
  Effect of lycium barbarum polysaccharides on human prostatic cancer cell line in-dependent of androgen apoptosis and apoptosis-related gene expression

    LI Zhuo-neng,LUO Qiong,YANG Ming-liang,et al.

  Department of Hygiene,School of Public Health,Wuhan University,Wuhan430071,China

  【Abstract】 Objective The aim of this study was to investigate the influence of Lycium barbarum polysaccharides(LBP)on human prostatic cancer cell line PC-3and its Bcl-2and Bax expression.Methods We cultured human prostate cancer PC-3cell in vitro and added the LBP to the medium at different concentrations.the MTT assay was used to measure the proliferation of PC-3cell.TUNEL was used to investigate the effects of LBP on PC-3cell apoptosis and immunohistochemical technique was used to detect the Bcl-2and the Bax expression.Results LBP could inhibit the growth of PC-3cell line.LBP can induce apoptosis and the apoptosis rate is41.5%,the ratio of Bcl-2/Bax protein decreased significantly with a dose-effect relationship.Conclusion LBP inhibits PC-3cell line independent of androgen in vitro,and the mechanisms may be related to its influence on the cell cycle and induc-ing of apoptosis.

  【Key words】 lycium barbarum polysaccharide;human prostatic cancer cell;apoptosis;Bcl-2;Bax

  隨著經濟水平的提高,生活方式的改變和人均壽命的延長,前列腺癌的發病率有日益增多的趨勢 [1] ,我國前列腺癌的發病率約為2.41/10萬男性人口 [2] 。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)是枸杞子(Fructus Lycii)的提取物,具有多種藥理作用和生物活性功能 [3] 及抗腫瘤功能 [4] ,并能誘導人前列腺癌PC-3細胞凋亡從而抑制其增殖 [5] 。然而其誘導前列腺癌PC-3細胞凋亡的機制還不明了。本文擬進一步探討枸杞多糖對人前列腺癌PC-3細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2和Bax表達的影響,以探討枸杞多糖抗前列腺癌的可能機制。

  1 材料與方法

  1.1 試品及試劑

    1.1.1 枸杞多糖 由本實驗室制備。

    1.1.2 細胞株及培養條件 雄激素不依賴型人前列腺癌細胞株PC-3由華中科技大學同濟醫學院提供,在含體積分數為10%的小牛血清中加入雙抗的F12培養液(Gibco),37℃,5%CO 2 培養。

  1.2 方法
   
    1.2.1 實驗分組及處理 實驗設1個空白對照組和5個不同濃度實驗組,分別為LBP100μg/ml、LBP200μg/ml、LBP400μg/ml、LBP800μg/ml和LBP1000μg/ml。取對數生長期的PC-3細胞1×10 4 個/ml接種于25ml的培養瓶培養,24h后加入前述不同濃度的LBP,作用48h后,胰酶消化離心,將細胞懸浮于PBS中,調濃度為1×10 6 個/ml細胞懸液,備用。

    1.2.2 原位末端標記法(TUNEL) 由武漢博士德公司提供TUNEL檢測試劑盒。光鏡下,胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞,即凋亡細胞。隨機計數200個細胞,算出陽性細胞率。

    1.2.3 Bcl-2和Bax蛋白檢測 按成套Bcl-2和Bax蛋白免疫組化染色試劑盒(武漢博士德公司)說明操作。光鏡下觀察胞漿、胞膜出現棕褐色的為陽性細胞,隨機計數200個細胞,算出陽性細胞率。

    1.3 數據統計 所有的數據均用ˉx±s表示,采用SPSS軟件包分析數據,各組間指數的比較采用單因素方差分析和t檢驗

  2 結果

    2.1 枸杞多糖對人前列腺癌PC-3細胞生長的抑制作用 不同濃度的枸杞多糖對體外培養的PC-3細胞有抑制作用,并隨劑量的增加其抑制作用加強,最大抑制率可達到87.84%。100μg/ml與200μg/ml組,與對照組比較差異有顯著性P<0.05;400μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml組,與對照組比較差異有非常顯著性P<0.01,結果見表1。表1 枸杞多糖對人前列腺癌細胞PC-3細胞增殖的抑制作用 (略)注:與對照組比較, * P<0.05, ** P<0.01

    2.2 原位(缺口)末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡 形態學觀察見TUNEL陽性細胞及凋亡細胞核染呈棕褐色,具有典型凋亡特征,表現為細胞縮小、核濃縮、核碎裂等。對照組的凋亡細胞明顯少于實驗組細胞。由表2可知,實驗組PC-3細胞凋亡率明顯比對照組高(P<0.01);其中1000μg/ml組的凋亡率最高(41.5%)。表2 枸杞多糖對PC-3細胞凋亡作用TUNEL檢測結果 (略)注:與對照組比較, * P<0.01

    2.3 凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達的檢測 Bcl-2、Bax陽性表達的細胞可見明顯的黃棕色細胞輪廓及黃染的胞漿。各實驗組的凋亡抑制蛋白Bcl-2表達均比對照組低,而促凋亡蛋白Bax的表達比對照組強。由表3可更清楚的知道Bcl-2和Bax蛋白表達的變化:與空白對照組相比,各劑量組Bcl-2陽性反應物強度明顯降低,染色變淺(P<0.01)。對照組的Bax表達最弱,與各枸杞多糖實驗劑量組差異明顯(P<0.01)。表3 枸杞多糖對PC-3細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響(略)注:與(1)比較, * P<0.01

  3 討論

  近10年來,國內外學者的大量研究證實,多糖可影響腫瘤的發生與發展,具有抗癌、抗突變作用 [6] ,有的多糖如銀耳多糖、香菇多糖等,已成為國際上評價最高的抗癌藥之一 [7] 。前列腺癌已經成為最常見的男性惡性腫瘤 [8] ,根治前列腺癌的關鍵在于抑制癌細胞 [9] 。腫瘤的發生和發展是一個復雜的多階段的過程,實際是多種腫瘤相關基因表達失常或許多腫瘤抑制基因失活所致。這類基因的主要功能是參與細胞增殖、分化和衰亡即凋亡等基本生命過程的調控。當這類基因由于某種原因發生突變、重排、缺失、擴增而被異常激活或失活時,正常的受控增殖、分化或凋亡受到干擾,于是細胞無限增殖、分化受阻或壽命延長而形成腫瘤。因而研究腫瘤細胞中基因的變化,有助于從分子水平了解細胞癌變機制。凋亡抑制基因bcl-2及其表達蛋白能夠抑制或阻斷多種因素引起的細胞凋亡,而促凋亡基因bax是bcl-2家族的一個重要成員,恰恰與bcl-2有相反的生物效應,它的顯著表達能促進細胞體的凋亡。在體內Bcl-2、Bax蛋白可形成異質二聚體,兩者劑量的比率決定細胞凋亡的敏感性,當Bcl-2/Bax增大則細胞存活,反之則易凋亡 [10,11] 。

    本研究的結果表明Bcl-2/Bax蛋白表達比值越小的組凋亡越明顯,且表現出明顯的劑量依賴性。可以認為枸杞多糖可能是通過調節Bcl-2和Bax蛋白的表達而誘導腫瘤細胞的凋亡,進而起到了抗腫瘤的作用的。但LBP是通過什么途徑影響Bcl-2和Bax的表達,需要進一步研究。

  【參考文獻】

  1 Gu FL,Xia TL,Kong XD.Preliminary study of the frequency of benign prostatic hyperplasia and prostate cancer in China.Urology,1994,44:688-691.

    2 鮑鎮美.前列腺癌的治療.中華泌尿外科雜志,1997,5:315-320.

    3 薛立文,李以暖.枸杞子的營養和保健功能.廣東微量元素科學,2000,7(6):1-4.4 甘璐,張聲華.枸杞多糖的抗腫瘤活性和對免疫功能的影響.營養學報,2003,6:200-202.

    5 李卓能,羅瓊,楊明亮,等.枸杞多糖對人前列腺癌細胞生長的抑制作用.中華中西醫雜志,2005,1:5-6.

    6 J Han.Highlights of the cancer chemoprevention studies in china.Pre-ventive Medicine,1993,22:712.

    7 千原吳郎.抗癌劑の現狀と將來特に生藥藥理の觀點かさ.藥學雜志,1988,108(3):171.

    8 Garnick MB.Prostate cancer:screening,diagnosis,and management.Ann Intern Med,1993,118:804-818.

    9 Chodak GW.Single agent therapy with bicalutamide:A comparison with medical and surgical castration in the treatment of advanced prostate cancer.Urology,1995,46:849.

    10 屈紀富,程天民,許霖水.放創復合傷皮膚傷口成纖維細胞凋亡變化及其機理研究.中華放射醫學與防護雜志,2002,22:155-158.

    11 Saxena A,Moshynska O,Sankaran K,et al.Association of a novel sin-gle nucleotide polymorphism,G(-248)A,in the5′-UTR of BAX gene in chronic lymphocytic leukemia with disease progression and treatment resistance.Cancer Letters,2002,187:199-205.

  作者單位:430071湖北武漢,武漢大學公共衛生學院衛生學教研室(Δ 通訊作者)

   (編輯:秋 實)


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