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高脂血癥對實驗性腎病大鼠腎臟TGF-β1 基因表達的影響

來源:中華醫學研究雜志 作者:彭 文,劉育軍,孫仲倫 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 目的 本研究觀察高脂飲食對阿霉素腎病(ADR)模型大鼠腎臟TGF-β 1 基因表達的影響,并探討辛伐他汀及苯那普利對ADR大鼠腎臟TGF-β 1 基因表達的影響。 方法 根據大鼠TGF-β 1 cDNA的序列,設計TGF-β 1 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)的引物,以RT-PCR法觀察不同組大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA在4,8,12周時的表達,......


  【摘要】 目的  本研究觀察高脂飲食對阿霉素腎病(ADR)模型大鼠腎臟TGF-β 1 基因表達的影響,并探討辛伐他汀及苯那普利對ADR大鼠腎臟TGF-β 1 基因表達的影響。 方法  根據大鼠TGF-β 1 cDNA的序列,設計TGF-β 1 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)的引物,以RT-PCR法觀察不同組大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA在4,8,12周時的表達,并以GAPDH為內參照;標記(地高辛)TGF-β 1 探針,在不同組大鼠的腎組織冰凍切片上作原位雜交,檢測12周時大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA的表達情況。 結果  高脂飲食ADR大鼠4,8,12周時腎臟TGF-β 1 mRNA表達逐步上調,8,12周明顯高于普通飼料腎病大鼠,12周時原位雜交結果表明高脂飲食腎病組腎臟TGF-β 1 mRNA增強明顯,以小管間質為主,而普通飼料腎病組TGF-β 1 mRNA表達主要在小管間質,呈局灶性分布;辛伐他汀組和苯那普利組大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA表達較高脂飲食腎病大鼠組明顯降低;正常大鼠高脂飲食組TGF-β 1 mRNA表達在12周時高于正常對照組。 結論  高脂飲食ADR大鼠腎臟促纖維化因子TGF-β 1 mRNA隨時間延長表達明顯上調,表達以小管間質為主;辛伐他汀及苯那普利能明顯降低腎臟TGF-β 1 mRNA的表達,辛伐他汀降低腎臟TGF-β 1 mRNA的作用機制可能與降低高脂血癥相關的RAS活性有關,還可能與抑制MVA通路的間接作用有關;而苯那普利降低大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA表達與其直接抑制AngⅡ介導作用有關。
 
  【關鍵詞】  高脂血癥;纖維化;TGF-β 1 ;辛伐他汀;苯那普利
     

  Study on renal expression of TGF-β1 mRNA in ADR-induced experimental nephrotic rats given high lipid diet

    PENGWen,LIUYu-jun,SUN Zhong-lun.

  Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM,Shanghai200062,China

  【Abstracts】 Objective This study was to examine the changes of renal TGF-β 1 mRNA expression in ADR exper-imental nephropathy rats given high lipid diet and the effect of using simvastatin and benazepril.Methods Using RT-PCR to detect the expression of renal TGF-β 1 mRNA in different groups at4,8and12weekend,the GAPDH mR-NA expression used as control.Using in situ hybridization to examine TGF-β 1 gene expression in different groups at12weekend.Results TGF-β 1 mRNA expression of ADR nephrotic rats increased steadily after4weekend and its gene expression was higher than that with normal diet at8and12weekend.The results of using in situ hibrydization showed high level of TGF-β 1 mRNA positive signal at12weekend in ADR nephrotic rats given high lipid diet,the positive signals mainly located in tubulointerstitial zone disseminately while few found in glomerular,and focal gene positive signals distributed in tubulointerstitial was showed in normal dietary nephrotic rats.The expression of TGF-β 1 mRNA decreased in Simvastatin and Benazepril groups significantly.There was no different expression of TGF-β 1 mR-NA between normal rats given high lipid diet and normal diet during4and8weekend but slight higher gene expression came in high lipid dietary group at12weekend compared with normal control.Conclusion The expression of TGF-β 1 mRNA in ADR nephrotic rats given high lipid diet increased steadily as time went on,the positve signals of TGF-β 1 mRNA mainly located in tubulointerstitial zone.The treatment of simvastatinor benazepril were proved to be effec-tive in decreasing the high expression of TGF-β 1 mRNA in ADR nephrotic rats given high lipid diet.The possible ef-fect of simvastatin is due to reducing the activity of RAS induced by hyperlipidemia or through its negative effect on MVA pathway;while benazepril's inhibition on this gene expression might be mediated by inhibiting the production of angiotensinⅡ.

  【Key words】 hyperlipidemia;fibrosis;TGF-β 1 ;simvastatin;benazepril

  動物模型中,高脂飲食在一定的觀察期后能形成類似人FSGS病變。腎病大鼠給予高脂飲食后,腎小球硬化明顯加重,并加速進展至CRF [1] 。近年來,大量的研究顯示多種細胞因子參與腎病進程,其中起主要作用的是TGF-β 1[2] 。TGF-β 1 廣泛分布于血小板,巨噬細胞及腎臟組織,能通過增加ECM蛋白的合成,抑制其降解及調節細胞-整合素受體促進ECM的積聚,并吸引單核細胞和刺激成纖維細胞轉變成纖維細胞,促進腎臟硬化 [3] 。目前認為,TGF-β 1 在腎組織中持續過度表達是引起腎小球硬化的重要原因 [4] 。我們用RT-PCR和原位雜交觀察高脂飲食ADR腎病大鼠腎臟的TGF-β 1 的基因表達及在腎小球,腎小管間質的分布,并分別觀察辛伐他汀和苯那普利對高脂飲食腎病大鼠腎臟TGF-β 1 的基因表達的影響,及高脂飲食正常大鼠12周時TGF-β 1 基因表達。
 
  1 材料與方法

    1.1 實驗動物與分組 雄性SD大鼠60只(由上海醫科大學動物房提供),體重(190±10)g,ADR制成腎病模型,將實驗動物隨機分為腎病+高脂飼料組(AH),腎病+高脂飼料+辛伐他汀組(AHS),腎病+高脂飼料+苯那普利組(AHB),高脂飼料組(HC),普通飼料+阿霉素組(AC)及正常對照組(C),每組10只。根據大鼠TGF-β 1 cDNA的序列,設計TGF-β 1 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)的引物,以RT-PCR法觀察不同組大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA在4,8,12周時的表達,并以GAPDH為內參照在紫外光激發下,用樂 凱黑白膠片拍照,用T90型圖像處理系統對膠片進行分析。采用固有RNA法進行RT-PCR的半定量分析。用GAPDH mRNA作為內參照,檢測不同處理方法對大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA水平的影響。用相同的逆轉錄產物進行PCR,使其控制在指數期,用GAPDH產物的光密度值校正TGF-β 1 產物的光密度值,然后用校正值進行統計分析。標記(地高辛)TGF-β 1 探針,在不同組大鼠的腎組織冰凍切片上作原位雜交,檢測12周時大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA的表達情況。

  1.2 試劑 總RNA提取試劑盒購自Promega公司;TGF-β 1 原位雜交試劑盒購自Boehringer Mannheim公司。

    1.3 統計學分析 采用EPI5.0軟件對數據進行統計分析。各指標均用ˉx±s表示,兩組間比較采用t檢驗。 2 結果 見表1,圖1。(略)

    表1 各組大鼠腎臟RT-PCR檢測TGF-β 1 產物mRNA的cDNA水平變化(略)
   
    注:各組大鼠腎臟RT-PCR檢測TGF-β 1 產物mRNA的cDNA水平4,8,12周與4周比較a:P>0.05,b:P<0.05;各組大鼠腎臟RT-PCR檢測TGF-β 1 產物mRNA的cDNA水平8,12周與AH組比較:c:P<0.05與AC組相比均明顯升高,半定量分析也表明AH組腎臟TGF-β 1 產物mRNA的cDNA由4w至8w上升明顯,而由8w至12w升高幅度減緩;AHS組8w,12w時較AH組有明顯差別,與AC組差異不顯著;AHB組腎臟TGF-β 1 產物mRNA的cDNA8w,12w時較AHS組略低,無顯著差異;但其8w,12w腎臟TGF-β 1 產物mRNA的cDNA水平略高于HC組。HC組腎臟TGF-β 1 產物mRNA的cDNA8w,12w時較C組相比無顯著差異。

    原位雜交結果顯示:AH組大鼠在12w時可見腎小管細胞有藍褐色陽性細胞,彌漫,腎小球染色略淺,表明TGF-β 1 mRNA在本組大鼠中信號已明顯增強,且彌漫性分布;AC組大鼠在12w時可見腎小管間質細胞有藍褐色陽性信號,局灶,腎小球染色淺,表明TGF-β 1 mRNA表達比高脂飲食腎病大鼠局限;AHS組大鼠12w時TGF-β 1 mRNA陽性細胞在小管中明顯,分布散在,信號較弱;AHB大鼠在12w時TGF-β 1 mRNA陽性細胞在小管中弱,低于AHS組;HC組12w時TGF-β 1 mRNA陽性信號細胞在小管中弱,少量散在分布,腎小球無陽性信號;C組大鼠12w時腎小球及腎小管均未見陽性信號細胞。

  3 討論

    在不同的大鼠腎臟病變模型中,人們觀察到高脂血癥在加重腎臟病變的同時,可伴隨腎臟TGF-β 1 mRNA的表達增高,并發現其表達與腎臟的病變程度密切相關 [5] ,表明高脂血癥至少部分通過TGF-β 1 引起腎臟損害。

  現有的研究表明TGF-β 1 是一促纖維化生長因子,既有促進組織細胞增殖的特性,又有促進纖維化的作用,其能促進許多器官的纖維化。TGF-β 1 可明顯增加培養的腎小球系膜細胞的數量 [6] ,還直接刺激基質分子如FN,膠原和蛋白聚糖的合成,抑制蛋白酶的分泌及誘導蛋白酶抑制劑的產生以阻止基質的降解 [7] 。TGF-β 1 可通過多種途徑誘導組織纖維化,除促進腎小球硬化和腎小管上皮細胞凋亡外,還通過自分泌及旁分泌機制使間質成纖維細胞分化為纖維細胞,最終導致間質纖維化 [8] 。本研究采用兩種方法觀察高脂飲食ADR腎病大鼠腎臟的TGF-β 1 mRNA表達,用半定量RT-PCR法發現皮質腎組織TGF-β 1 mRNA在8,12w時均高于普通飼料腎病大鼠,與其腎臟形態學檢查結果相一致。原位雜交也顯示12w時高脂飲食ADR腎病組腎臟TGF-β 1 mRNA在腎小球及小管間質均呈陽性信號,呈彌漫分布,小管間質信號強,而普通飼料腎病組腎小球內陽性信號弱,小管間質僅呈局灶性變化,表明高脂飲食明顯增強腎病大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA的表達,分布以小管間質為主。而腎臟TGF-β 1 mRNA的高表達可明顯加重腎臟的纖維化病變,因此認為高脂血癥可能通過TGF-β 1 的作用促進腎病的進程。

    實驗觀察到辛伐他汀對高脂飲食腎病大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA表達的影響表現在治療組大鼠腎臟腎小球及小管間質細胞陽性信號均較未治療組明顯減弱,且小管中陽性細胞呈局灶性分布,表明辛伐他汀在控制高脂血癥的同時,不僅減輕腎小球和小管病變,還明顯降低腎臟TGF-β 1 mRNA的表達強度,從而延緩腎臟的纖維化。但辛伐他汀如何降低TGF-β 1 mRNA在腎臟表達的確切機制不甚明了。有研究表明高脂血癥時可出現RAS活性增高 [9] ,因此,我們認為辛伐他汀降低腎病大鼠腎臟TGF-β 1 的基因表達可能與其降低高脂血癥而間接地抑制腎素-血管緊張素-TGF-β 1 軸的作用有關。

    ACEI被證明能顯著減輕或延緩腎臟的纖維化,作用機制與降低腎小球內壓,抑制系膜細胞的擴張及抑制AngⅡ引起的TGF-β 1 高表達有關。本研究用苯那普利治療高脂飲食ADR腎病大鼠,觀察到腎臟TGF-β 1 mRNA的表達明顯減弱,腎小球內陽性信號微弱,小管間質細胞中僅見少量的陽性信號,較辛伐他汀組大鼠的腎臟TGF-β 1 mRNA的表達低,表明抑制AngⅡ可明顯降低腎病大鼠腎臟的TGF-β 1 mRNA的表達。AngⅡ可刺激腎間質細胞增殖及增加ECM的積聚,引起小管間質損害 [10] 。另外,通過內分泌,旁分泌及自分泌增加的TGF-β 1 還引起小管間質ECM的積聚和纖維化。因此,在高脂飲食ADR腎病大鼠模型中,用苯那普利治療可減輕腎小球及小管間質病變,并下調腎臟TGF-β 1 mRNA的表達,進一步支持在慢性腎病過程中,抑制腎素-血管緊張素-TGF-β 1 對保護腎功能,延緩腎臟的硬化有重要意義。

    單純高脂飲食可引起大鼠腎臟FSGS的變化,本研究中單純高脂飲食僅觀察12w是為區別腎病模型組與正常型的差異。RT-PCR法12w時腎臟TGF-β 1 mRNA表達較正常增高,原位雜交中腎小球無陽性信號,腎小管僅見少量散在的陽性信號。結果表明高脂血癥正常大鼠12w時,盡管腎臟損傷輕微,但已有腎臟TGF-β 1 基因表達的增高,也就解釋腎臟疾病一旦發生,如不干預,則往往進行性發展的原因。
 
  【參考文獻】

  1 Jonathan R,Diamond,Morris JK.Exacerbation of chronic aminonucle-oside nephrosis by dietary cholesterol supplimentation.Kidney Int,1987,32671-677.

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    10 Woo KT,Lau YK.Proteinuria:clinical signficance and basis for thera-py.Singapore Med J,2001,42(8):385-389.

  作者單位:200062上海,上海中醫藥大學附屬普陀醫院腎內科

   (編輯:文 靜)


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