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牛磺酸對Fas系統介導燒傷后早期心肌細胞凋亡的影響

來源:中華醫學研究雜志 作者:萬福生龔文華趙小曼曾昭建余樂涵李華李國輝 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 觀察牛磺酸對燒傷后心肌細胞凋亡和Fas系統的影響及初步機制。方法 選健康Wistar大鼠,隨機分成對照組(Sham)、燒傷組(造成40%TBSA Ⅲ度燒傷)和燒傷加牛磺酸組(燙傷后即刻腹腔注射牛磺酸200mg/kg)。用原位末端標記(TUNEL)法檢測凋亡細胞,RT-PCR檢測Fas mRNA表達,免疫組化檢測Fas/FasL和Caspase-8/3蛋白表達......


    【摘要】  目的  觀察牛磺酸對燒傷后心肌細胞凋亡和Fas系統的影響及初步機制。方法  選健康Wistar大鼠,隨機分成對照組(Sham)、燒傷組(造成40%TBSA Ⅲ度燒傷)和燒傷加牛磺酸組(燙傷后即刻腹腔注射牛磺酸200mg/kg)。用原位末端標記(TUNEL)法檢測凋亡細胞,RT-PCR檢測Fas mRNA表達,免疫組化檢測Fas/FasL和Caspase-8/3蛋白表達和熒光分析Caspase-3活性。結果  燒傷組大鼠傷后6h、12h和24h心肌細胞凋亡指數分別為7.31±2.31、21.52±2.57和18.67±2.48,較對照組(0.92±0.34)有顯著性升高,Fas蛋白陽性表達指數分別為13.51±1.56、21.02±2.34和14.55±1.89,也顯著性高于對照組(2.46±0.75);Caspase-3活性分別為1.38±0.16、2.18±0.18和1.96±0.71,較對照組(0.35±0.06)差異有顯著性。牛磺酸保護組在傷后6h、12h和24h心肌細胞凋亡指數、Fas蛋白表達和Caspase-3活性較燒傷組均有不同程度降低(P<0.05)。燒傷組心肌細胞凋亡指數與Fas表達之間有良好的相關性(r=0.86,P<0.05)。結論  牛磺酸對Fas系統介導燒傷后大鼠心肌細胞凋亡有較好的抑制作用。

    【關鍵詞】  牛磺酸;Fas系統;細胞凋亡;心肌;燒傷
 
  Effects of taurine on Fas antigen involvement in apoptosis of cardiomyocytes in early postburn stage

  WAN Fu-sheng,Gong Wen-hua,ZHAO Xiao-man,et al.

  Department of Biochemistry and Molecular Biology of Jiangxi Medical College,Nanchang 330006,China

  【Abstract】  Objective  To investigate the effects of taurine on the apoptosis and expression change of Fas antigen in cardiomyocytes during the early postburn stage.Methods  Healthy adult Wister rats were randomly divided into the control group(without burned),the burned group(subjected to a 40% TBSA Ⅲ degree injury)and taurine treatment group(treated by intrapleural injuction taurine 200mg/kg).Terminal deoxynucleotidy transferase-mediated dUTP fluoescein nick end labeling(TUNEL),RT-PCR and S-P immunohistochemical staining were used respectively to determine the apoptosis and genes expression of Fas/FasL and caspase-8/3,and caspase-3 activity was detected by fluorospectrophotometry.Results  Cardiomyocytes apoptosis indexs of the burned groups at 6,12 and 24 postburn hours(PBHs)are 7.31±2.1,21.52±2.57 and 18.67±2.48 respectively,positive expression indexs of Fas protein are 13.51±1.56,21.02±2.34 and 14.55±1.89 respectively,caspase-3 activity are 1.38±0.16,2.18±0.18 and 1.96±0.71 respectively,compared with the control,there are all significant increase.There are good correlation(r=0.86,P<0.05)between cardiomyocytes apoptosis indexs and Fas gene expression of the burned groups.Compared with the burned group,cardiomyocytes apoptosis indexs,Fas gene expression and caspase-3 activity of taurine treatment group were all lowered significantly at 6,12 and 24 postburn hours(PBHs).Conclusion  Fas antigen is involved in the cardiomyocyte apoptosis during the early postburn stage,and taurine exerts a good antagonist action on both Fas gene expression and apoptosis in the cardiomyocytes.

  【Key words】  taurine;fas;apoptosis;cardiomyocyte;burn

    牛磺酸(Taurine,Tau)是心肌中含量最豐富的游離氨基酸,具有抗氧化,調節細胞滲透壓、抑制細胞鈣超載等多種生物學功能[1,2],是一種良好的內源性細胞保護劑。筆者曾發現牛磺酸對再灌注損傷心肌細胞凋亡有較好的拮抗作用[2],其機制可能與降低Fas死亡受體通路中相關蛋白酶水平及其活性有關[3]。隨著細胞凋亡現象在多種心血管疾病中被證實,Fas系統是否參與介導燒傷后心肌細胞凋亡成為目前關注的熱點。研究燒傷后不同時間心肌中Fas系統的表達變化與心肌細胞凋亡的關系,對闡明嚴重燒傷后心功能障礙甚至“休克心”發生的機制有重要意義[4,5],對嚴重燒傷后多臟器損害的防治也具有重要指導作用。牛磺酸對燒傷后心肌細胞凋亡的影響如何,尤其它是否調控Fas等凋亡相關基因的表達,目前尚未見報道。本研究旨在觀測牛磺酸對Fas系統參與嚴重燒傷后大鼠心肌細胞凋亡作用的影響及其初步機制。

  1  材料與方法

  1.1  燒傷模型制作[6]  選成年健康Wistar大鼠(由江西醫學院實驗動物中心提供)90只,雌雄各半,體重(243±25)g,隨機分成對照組(Sham),燒傷組(B)和燒傷加牛磺酸組(B+Tau)。(1)燒傷組:腹腔注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉,脫毛,24h后于92℃水浴18s,造成43% TBSA Ⅲ度燒傷(經病理切片證實),按每公斤體重1%燒傷面積4ml等滲鹽水腹腔注射,即將總量一半分為二等份,分別于傷后即刻和傷后4h注射,另一半分成4等份,分別于傷后8h,12h,16h及24h注射,分籠喂養大鼠,自由進食,飲水。并于傷后3h,6h,12h及24h處死動物,取心肌作有關分析。(2)燒傷加牛磺酸組(B+Tau):在傷后即刻腹腔注射牛磺酸(200mg/kg),余操作同燒傷組。(3)對照組(Sham):37℃水浴18s,不補液,1h后處死動物,余操作同燒傷組。

  1.2  凋亡細胞的原位末端標記(TUNEL)及半定量分析  心肌組織常規石蠟包埋、切片。采用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT酶)介導的帶熒光的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)標記凋亡細胞核中DNA3′末端(試劑購自美國Interge公司)。結果判斷:光鏡下正常心肌細胞核呈藍色,凋亡細胞核呈深淺不一的棕色,即陽性細胞。每張切片選擇5個視野,每個陽性視野計算200個細胞中陽性細胞數,以平均計算陽性細胞所占的百分比作為細胞凋亡指數(Apoptosis index,AI)。
 
  1.3  Fas/FasL和Caspase-8/3蛋白表達及半定量分析  取上述心肌石蠟標本相應部位的連續切片5張,按S-P法進行免疫組化及HRP-AEC染色(北京中山生物技術公司),第一抗體均為免抗鼠的Fas/FasL、Caspase-8及Caspase-3蛋白的多克隆抗體(santa Cruz公司)。每張切片于陽性區選擇5個無重疊視野,每視野計數200個心肌細胞中陽性細胞數,以計算陽性細胞所占的百分比作為待測蛋白陽性表達指數(Positive expression index,PEI)。

  1.4  Fas基因mRNA表達的檢測及半定量分析  采用RT-PCR檢測心肌中Fas及actin(作為內對照)的mRNA表達變化(試劑購自Promega公司),擴增Fas的引物序列為上游引物:5′CCAGGGACTGATAGCATCTTTGAGG 3′,下游引物為5′TGTGAAAGTCCTGAACCCTAAGG 3′;C-actin上游引物為:5′TCATGAAGTGTGACATCG 3′,下游引物為5′AAACTGCACGTGTGTAAAC 3′,Fas擴增片段的長度為436bp,C-actin擴增長度為289bp。擴增步驟主要為:(1)一步法提取總RNA,要求總RNA濃度A260/A280為1.7~2.0;(2)單管行RT-PCR反應;將mRNA逆轉錄成cDNA及cDNA擴增過程在同一管內進行(具體操作按藥盒說明書進行)。PCR反應條件為95℃ 2min,第1個循環,94℃ 30s,50℃ 30s,68℃ 60s重復35個循環,然后68℃延伸8min。(3)凝膠電泳與拍照:取10μl PCR反應產物于1.5%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)中電泳,紫外燈下觀察、拍照。經密度掃描儀掃描分析結果,以Fas/actin積分比值反映心肌細胞Fas基因的mRNA表達指標。

  1.5  心肌Caspase-3活性測定  取心肌0.3g,用冷生理鹽水洗2次,剪碎,在100目和200目尼龍網上,用眼科鑷子夾持,以冷PBS液沖洗,收集細胞置10ml離心管中,2000g離心5min,棄上清。用PBS(pH 7.4)洗沉淀2次,加細胞裂解液0.5ml,充分振蕩后,室溫下作用30min,15000g離心15min,取上清100μl加HEPES緩沖液1.0ml,再加AC-DEVD-AMC 10μg(1μg/μl),37℃水浴60min,于激發波長385nm,發射波長465nm,測其熒光強度變化,其活性單位用DEVD-AMC nmol/(h·mg)蛋白表示。

  1.6  統計學處理  所有實驗數據均以x±s表示,采用SPSS 11.0軟件處理分析,兩組間比較采用Student's t檢驗,多組間比較采用方差分析。

  2  結果

  2.1  燒傷后心肌細胞凋亡數目變化  與假燙傷組(Sham)比較,燒傷組大鼠在傷后6~24h的不同時相點的心肌細胞凋亡指數均有顯著性增加(P<0.01),在傷后12h,心肌細胞凋亡指數達峰值;燒傷加牛磺酸組心肌細胞凋亡指數顯著性地低于燒傷組(P<0.05),表明牛磺酸對燒傷后心肌細胞凋亡有較好的拮抗作用(表1)。

  表1  心肌細胞凋亡指數、Fas mRNA表達及Caspase-3活性  (略)

  2.2  心肌組織Fas基因mRNA表達  心肌組織Fas基因mRNA經RT-PCR和電泳檢測,經密度掃描儀測得Fas條帶(436bp)與C-actin條帶(389bp)峰面積積分,以Fas/actin比值表示Fas基因mRNA表達水平,結果顯示,燒傷后3h心肌Fas基因mRNA表達即呈顯著性升高,于傷后12h達峰值,傷后24h Fas基因mRNA表達仍顯著性高于假燙傷組。與燒傷組比較,在燒傷后3h,6h,12h及24h,燒傷加牛磺酸組心肌Fas mRNA的表達均有顯著性下降(P<0.05),表明牛磺酸對燒傷后心肌Fas基因mRNA表達有一定的抑制作用。

  2.3  心肌組織Fas/FasL、Caspase-8及Caspase-3蛋白表達的變化  燒傷組大鼠心肌Fas蛋白表達在傷后3h即顯著性高于對照組(P<0.05),于傷后12h達峰值,傷后24h仍顯著高于對照組;FasL蛋白僅在傷后12h較對照組差異有顯著性,Caspase-8蛋白在傷后3h也呈顯著性增高,傷后24h仍高于對照組:Caspase-3蛋白表達在傷后6h開始呈顯著性升高(見表2),傷后24h仍高于對照組。與燒傷組比較,燒傷加牛磺酸組心肌細胞中Fas Caspase-8及Caspase-3蛋白表達在傷后6h、12h及24h均呈顯著性降低(P<0.05)。

  表2  心肌組織Fas/FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表達水平  [略]

  2.4  心肌組織Caspase-3活性變化  燒傷組大鼠心肌Caspase-3活性在傷后3h即顯著高于對照組(見表1),傷后12h達峰值,傷后24h仍然高于對照組;燒傷加牛磺酸組心肌細胞中Caspase-3活性在傷后6h、12h及24h較燒傷組均呈顯著性降低(P<0.05)。

  2.5  心肌細胞凋亡與Fas系統表達的相關性  通過分析Fas蛋白表達指數(PEI)與心肌細胞凋亡指數(AI)間的關系,結果發現二者間有良好的相關性(r=0.86,P<0.05)。并發現Fas蛋白表達與Caspase-3活性間也存在相關性(r=0.83,P<0.05)。

  3  討論

  最近研究表明[7],細胞凋亡也參與了燒傷后心肌損害,其機制主要與線粒體結構與功能損傷、氧自由基及鈣平衡失調有關。然而,細胞凋亡在燒傷后心臟功能障礙中的病理生理意義目前尚未完全被闡明。不難設想,對心肌細胞凋亡及時防治,不僅有利于心肌細胞存活和心功能改善,也有利于嚴重燒傷后“休克心”的防治。目前,許多證據表明Fas系統參與了心力衰竭、病毒性心肌炎、心肌缺血及再灌注損傷的心肌細胞凋亡[8,9],但它是否介導嚴重燒傷早期心肌細胞凋亡尚未見報道。本研究結果顯示,燒傷組在燒傷后6h心肌細胞凋亡開始呈顯著性增多,心肌Fas mRNA和Fas蛋白表達在燒傷后3h即呈顯著性增高,傷后24h仍顯著高于對照組,Caspase-8蛋白和Caspase-3活性在傷后3h也均顯著高于對照組;燒傷加牛磺酸組心肌細胞凋亡指數與燒傷組比較有顯著性降低,且Fas mRNA和Caspase-8蛋白及Caspase-3活性均顯著低于燒傷組。相關性分析表明,燒傷后心肌細胞凋亡與Fas表達之間有良好的相關性,提示Fas系統參與了燒傷后心肌細胞凋亡,牛磺酸對燒傷后心肌細胞凋亡拮抗作用的機制可能與抑制Fas表達有關。導致燒傷后心肌細胞凋亡因素很多,其中心肌缺血(氧)及大量炎性細胞因子(如TNFα)分泌是最重要因素之一。一方面心肌缺血(氧)可誘導凋亡活化因子Mtd基因表達,促進細胞凋亡;另一方面缺血(氧)可誘導心肌細胞表面Fas表達增加,進而與FasL結合觸發凋亡的發生。

  目前認為,介導細胞凋亡的途徑主要有死亡受體通路、線粒體通路和內質網通路。其中以Fas死亡受體通路較為清晰[10,11],它是由死亡配體死亡受體結合激活半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)而導致細胞凋亡,其主要過程包括死亡受體分子的活化、凋亡酶復合體的形成,即Fas-FasL-FADD-Caspase-8酶原串聯構成的復合物及效應Caspase的活化。并認為Caspase是諸多調控通路的關鍵,三條凋亡通路最后都有Caspase的激活,而Caspase-3又處于Caspase級聯反應的中心地位。Fas(Apo-1,CD95)是由Fas基因表達的一種分布于多種細胞表面的膜受體蛋白分子,也是一種凋亡相關抗原,其配體(FasL)則用FasL基因表達的大分子蛋白[8]。研究表明[12]許多病理因素如缺血、缺氧及病毒感染等均可誘導Fas和FasL的表達,當FasL與Fas結合后,可誘導細胞凋亡。本實驗結果表明,心肌細胞凋亡是引起燒傷后心肌功能障礙的重要原因之一,Fas系統參與介導了燒傷后心肌細胞凋亡。通過抑制Fas系統信號通路中的某一環節或干預細胞凋亡,可望成為抑制燒傷后心肌細胞凋亡的重要手段。因此,牛磺酸對燒傷大鼠心肌Fas系統信號傳遞的拮抗作用及其機制,值得深入研究。

  【參考文獻】

  1  萬福生,劉波,趙小曼,等.牛磺酸對大鼠在體缺血再灌注心肌線粒體呼吸酶系的影響.基礎醫學與臨床,2000,20(4):333-335.

  2  萬福生,王青松,吳綺明,等.牛磺酸對心肌缺血損傷細胞凋亡與Fas/FasL基因表變化的影響.中國藥物與臨床,2004,4(1):17-19.

  3  伍偉鋒,劉唐威,黃林新.Fas/FasL與心肌細胞凋亡.醫學綜述,2001,7(2):73-74.

  4  黃躍生.燒傷后早期心肌損害的分子機制及防治研究進展.中華燒傷雜志,2004,10(5):257-259.

  5  李華,萬福生,楊薇,等.牛磺酸對心肌細胞凋亡的保護及其機制.南昌大學學報(理科版),2004,28(2):170-173.

  6  黃躍生,李志清,吳慶云,等.缺血缺氧在大鼠燒傷后“休克心”中的作用及其機制研究.中華創傷雜志,2002,18(4):205-209.

  7  張家平,黃躍生,周新.嚴重燒傷大鼠心肌細胞凋亡與心功能損害的關系.中華燒傷雜志,2002,18(5):272-274.

  8  Timmer T,De Vries EG,De Jony S.Fas receptor-mediated apoptosis:a clinical application.J Pathol,2002,196(2):125-134.

  9  Harald.The Fas signaling pathway:more than a paradigm.Science,2002,296(31):1635-1636.

  10  Shigekazu N.Apoptosis by death factor.Cell,1997,88:357.

  11  李曉玲,鄭德先.死亡受體的信號傳導途徑及其調節機制.國外醫學·分子生物學分冊,2002,24(4):225-228.

  12  Chen YJ,Zhang X,Bu XY,et al.The Expression of Fas and Fas ligand in human gliomas.J Fourth Mil Med Univ,2000,21:80-82.

  基金項目:國家自然基金資助項目(No.30060029)

  作者單位:1 330006 江西南昌,江西醫學院生化與分子生物學教研室

       2 330006 江西南昌,江西醫學院附屬第一醫院燒傷中心

  (編輯:秋  實)


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