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毛細管區帶電泳分離和檢測利多卡因方法的研究

來源:中華醫學研究雜志 作者:馬漢祥劉紅呂淞高改莉施偉忠李鋒 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 建立毛細管電泳分離和檢測利多卡因的方法。方法 毛細管區帶電泳分離利多卡因,電泳分離條件:30mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH=5。先采用壓力(20psi)進水5s,隨后電動進樣(8kV,5s),檢測波長200nm,運行電壓30kV,溫度20℃,運行時間5min。方法的檢測限10ng/ml。...


    【摘要】  目的  建立毛細管電泳分離和檢測利多卡因的方法。方法  毛細管區帶電泳分離利多卡因,電泳分離條件:30mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH=5.0)緩沖液。先采用壓力(20psi)進水5s,隨后電動進樣(8kV,5s),檢測波長200nm,運行電壓30kV,溫度20℃,運行時間5min。結果  在0.1~12.5μg/ml范圍內呈良好的線性關系和重現性(R2=0.9998,n=5),回收率96.80%~105.8%,日內及日間精密度(RSD)均小于6%。方法的檢測限10ng/ml。結論  本方法簡便、快速、靈敏,為利多卡因的定量測定提供了新的、更為理想的方法學手段。

    【關鍵詞】  毛細管區帶電泳;分離;利多卡因
   
  Determination of lidocaine by capillary zone electrophoresis

  MA Han-xiang, LIU Hong, LV Song, et al.

  Department of Anesthesiology, the Affiliated Hospital of Ningxia Medical College, Yinchuan 750004, China

  【Abstract】  Objective  To establish capillary zone electrophoresis method for the determination and separation of lidocaine.Methods  Determination and separation of lidocaine by capillary zone electrophoresis (CZE) and electrophoresis conditions were as following: buffer was 30mmol/L NaH2PO4-H3PO4 solution (pH=5.0), the working voltage at 30kV, temperature at 20℃, UV detection at 200nm, sampling injected 5 seconds with voltage at 8kV.Results  The established method had a good linearity and precision within the concentration range of 0.1~12.5μg/ml(R2=0.9998). The range of recovery was 96.8%~105.8%, and relative standard deviations of inter-day and intra-day were less than 6%. The detection limit was 10ng/ml.Conclusion  This assay was simple, rapid and sensitive. It is a new and ideal analytical means for the determination of lidocaine.

  【Key words】  CZE; lidocaine; separation

    利多卡因屬于酰胺類中效局麻藥,具有起效快、彌散廣、穿透性強、安全范圍較大、無擴張血管作用及對組織無刺激等特點,可用于多種形式的局部麻醉,也是抗心律失常的常用藥物之一。硬膜外阻滯用量為400mg,其血藥濃度達2~4μg/ml。當血藥濃度超過5μg/ml時出現中毒癥狀,超過7μg/ml時出現驚厥[1],因此其血藥濃度監測具有重要的臨床意義。以往多采用酶免疫分析法[2]、氣相和高效液相色譜法[3]。但成本高,操作繁瑣,干擾多,色譜柱易受污染等。而毛細管電泳(Capillary electrophoresis, CE)是20世紀90年代以來迅速發展起來的一種新型的分離檢測手段,具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、運行成本低、預處理簡單以及應用范圍廣等技術優勢,已在生物醫藥領域獲得了許多成功的應用[4]。本研究結合利多卡因的結構特點,選用毛細管區帶電泳(CZE)分離模式,優化緩沖體系、pH值、檢測波長、分離電壓和溫度等條件,建立了適合利多卡因定量測定的CZE方法。

  1  材料與方法

  1.1  儀器與試劑  毛細管電泳儀:美國Beckman公司P/ACE5000型配有紫外吸收(UV)、二極管陣列(PDA)和Beckman工作站;毛細管為涂層石英毛細管,57cm×75μm(河北永年光纖廠),有效長度50cm;PHS-3B精密pH計(上海精密科學儀器有限公司);SB2200T超聲波洗滌裝置(必能超聲上海有限公司)。
    利多卡因(針劑,0.1g/5ml,山東兗州益健制藥有限公司批號:0407182);利多卡因標準品(寧夏醫學院附屬醫院制劑中心 批號:030408)。NaH2PO4、H3PO4 、HCI和NaOH等試劑均為國產分析純,水為自制雙蒸去離子水。

  1.2  樣品溶液和緩沖液的制備

  1.2.1  標準品及樣品溶液的配制  準確稱取利多卡因標準品10mg,用雙蒸去離子水溶解至100ml。分別配制濃度為12.5、6.25、2.5、0.5和0.1μg/ml標準溶液,用雙蒸去離子配制不同濃度的利多卡因樣品。用0.45μm微孔過濾器過濾,超聲波脫氣5min后備用。

  1.2.2  運行緩沖液的配制  精密稱取NaH2PO4適量,加水制成15~40mmol/L NaH2PO4。用H3PO4和NaOH將其pH值分別調為4.4、4.6、4.8、5.0和5.2低溫貯備。

  1.3  實驗條件的選擇  開機后,以1mol/L HCI、0.1mol/L NaOH溶液、水及NaH2PO4-H3PO4緩沖液沖洗毛細管各3min,兩次進樣之間以0.1mol/L NaOH溶液、水及緩沖液沖洗毛細管3min后進樣:先采用壓力(20psi)進水5s,隨后電動進樣(8kV,5s),運行時間5min。以遷移時間、峰高、峰面積的重現性和峰形的對稱性作為分離效果的判斷依據,綜合上述參數優化實驗條件。

  1.3.1  緩沖體系  根據利多卡因的理化性質及緩沖液的選擇原則,選擇NaH2PO4-H3PO4為實驗的緩沖體系。再以1.2.2項配制的緩沖液選擇最佳運行緩沖液濃度和pH值。

  1.3.2  檢測波長及進樣條件  根據利多卡因的理化性質,以PDA檢測器進行掃描。在200nm有較大吸收峰。因此,確定采用200nm作為UV檢測波長;先采用壓力(20psi)進水5s,隨后電動(8kV,5s)進樣。

  1.3.3  分離電壓和溫度  分別采用15、18、20、23、25、28及30kV作為分離電壓,選擇最佳分離電壓;分別在柱溫為15℃、18℃、20℃、22℃、25℃、28℃及30℃,選擇最佳柱溫。

  1.4  重現性和最低檢測限  為確定上述分析條件下定量分析的精密度,考察利多卡因的相對遷移時間和校正峰面積的重現性。重復8次進樣,計算遷移時間的相對標準差(RSD)和校正峰面積的RSD。當電泳峰高與噪聲比值(S/N)為3時, 計算利多卡因的最低檢測限。

  1.5  回收率和精密度  以12.5、2.5、0.5μg /ml高中低3種濃度的利多卡因分別進行CZE分析,以校正峰面積計算得出的利多卡因濃度與加入的利多卡因量之比計算回收率;同法,1d內平行測定5次,測得日內精密度;連續5d,每日測定高中低3種濃度各1次,測得日間精密度。

  2  實驗結果

  2.1  在所選擇的實驗條件下,利多卡因獲得滿意的分離。以藥物濃度為橫坐標(C),校正峰面積為縱坐標(A)進行線形回歸。在0.1~12.5μg /ml范圍內線形關系良好:C=0.0004193×A+0.0627, R2=0.9998。優化條件下的利多卡因(12.5μg/ml)CZE圖譜見圖1。

  圖1  利多卡因區帶電泳圖譜 略

  2.2  實驗條件的選擇  30mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH=5.0)為最佳緩沖液,見表1,表2。

  表1  不同濃度的緩沖液對利多卡因分離度的影響 略
 
  表2  pH對利多卡因分離度的影響 略

  最佳檢測波長200nm、運行電壓30kV、實驗溫度20℃。見表3,表4。

  表3  工作電壓對利多卡因分離度的影響 略

  表4  柱溫對利多卡因分離度的影響 略

  2.3  回收率和精密度  平均回收率為96.8%~105.8%;日內、日間RSD小于6%。見表5。

  表5  加樣回收率和精密度測定結果 略

  2.4  重現性和最低檢測限  相對遷移時間的RSD小于4%,相對校正峰面積RSD小于6%。利多卡因的最低檢測限為10ng/ml。

  3  討論

  本研究主要探討毛細管電泳條件的選擇和優化。毛細管區帶電泳法中,不同的緩沖體系、緩沖液pH值、溫度、電壓、檢測波長以及進樣方式都會影響樣品的保留時間、吸收度、重復性和峰形[5,6]。

  緩沖體系不合適,分離效果會很差,甚至導致分離失敗。緩沖液的pH直接影響待分離樣品表面的電荷量及毛細管表面的電荷密度[5]。本研究結果顯示30mmol/L NaH2PO4-H3PO4緩沖體系在pH=5.0為最佳。電壓是影響徑向電場的主要因素之一,可以改變樣品的分離效率和速度。采用高電壓,將使分離時間大大縮短,從理論上講將提高分辨率[6]。但電壓太高將使電泳過程中產生的焦耳熱無法及時散發,引起分辨率降低,峰形變寬等現象。電壓太低,分離時間會延長并且會影響分離效果。本實驗結果提示在28kV和30kV時,峰形和吸收度無差別,但30kV時,分離時間較短。溫度的改變將影響電極緩沖液的粘度,當溫度升高時,粘度降低,從而使電流升高,電滲流增大,分離時間縮短。但溫度太高,會使毛細管中產生的焦耳熱難以及時散發,引起峰形變寬,影響分離效果。溫度過低會使分離時間延長,本實驗結果20℃最佳。

  本實驗毛細管區帶電泳分離利多卡因的優化條件為:緩沖液為30mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH=5.0);先采用壓力(20psi)進水5s,隨后電動進樣(8kV, 5s);檢測波長200nm;運行電壓30kV;柱溫20℃。本研究應用毛細管區帶電泳法分離并定量分析利多卡因,為臨床開展利多卡因血藥濃度監測奠定了基礎。

  【參考文獻】

  1  莊心良,曾因明,陳伯鑒.現代麻醉學.第三版.北京:人民衛生出版社,2003,951-960.

  2  Pape BE, Whiting R, Parker KM, et al. Enzyme immunoassay and gas-liquid chromatography compared for determination of lidocaine in serum. Clin Chem,1978, 24:2020-2022.

  3  Swezey CB, Ponzo JL. Liquid chromatographic determination of lidocaine in serum. Clin Biochem,1984,17:230-232.

  4  王義明,羅國安,魏偉,等.毛細管電泳在醫藥領域中的應用.色譜,1997,15:494-498.

  5  羅國安,王義明.毛細管電泳的原理及應用.色譜,1995,13:437-407.

  6  謝瑩,林梅,張正行,等.提高毛細管電泳重現性的幾種方法.藥學進展,1999,23:261-264.

  作者單位: 750004 寧夏銀川,寧夏醫學院附屬醫院麻醉科

  (編輯:文  靜)


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