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PDTC對壓力負荷過度誘導小鼠心肌肥大的防護作用及其機制研究

來源:中華醫學研究雜志 作者:李躍華李菁闕玲俐 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 觀察吡咯烷二硫基甲酸鹽(PDTC)對心肌肥大發生發展的影響并探討其機制。方法 以縮窄小鼠主動脈弓(TAC)誘導的心肌肥大為模型,觀察PDTC對心肌肥大發生發展的影響,并采用EMSA檢測心肌組織中NF-κB結合活性,應用Western blot方法分析心肌組織中phospho-GSK3β的表達水平。01),而且肥大心肌組織中NF-κB結......


    【摘要】  目的  觀察吡咯烷二硫基甲酸鹽(PDTC)對心肌肥大發生發展的影響并探討其機制。方法  以縮窄小鼠主動脈弓(TAC)誘導的心肌肥大為模型,觀察PDTC對心肌肥大發生發展的影響,并采用EMSA檢測心肌組織中NF-κB結合活性,應用Western blot方法分析心肌組織中phospho-GSK3β的表達水平。結果  (1)縮窄小鼠主動脈弓2周后,心臟重量/體重比值與假手術組相比增高48.7% (P<0.01),而且肥大心肌組織中NF-κB結合活性和phospho-GSK3β(Ser9)蛋白表達明顯高于假手術組(P<0.01)。(2)PDTC可明顯減輕TAC誘導的心肌肥大,與TAC模型組相比可以使小鼠心臟重量/體重比值下降16.4%(P<0.05)。PDTC可抑制心肌組織中NF-κB活性,與TAC模型組相比降低了34.3%(P<0.01),同時亦可抑制心肌組織中GSK3β(Ser9)磷酸化水平,p-GSK3β(Ser9)/ GSK3β比TAC模型組降低了22.1%(P<0.05)。結論  PDTC可以通過抑制NF-κB結合活性和GSK3β(Ser9)磷酸化水平延緩心肌肥大的發生發展。

  【關鍵詞】  心肌肥大;吡咯烷二硫基甲酸鹽;核因子κB; 糖原合成激酶-3β
   
  The preventive effect and mechanism of PDTC on the development of mice cardiac hypertrophy induced by pressure overload

  LI Yue-hua,LI Jing,QUE Ling-Li.

  Department of Pathophysiology,Nanjing Medical University,Najing 210029,China

  【Abstract】  Objective  To investigate the role and mechanism of PDTC on the development of cardiac hypertrophy in vivo.Methods  PVB/N mice were employed and cardiac hypertrophy was induced by transverse aortic constriction for 2 weeks.Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to determine NFkB binding activity with nuclear proteins extracted from heart tissues; Western blots were performed to examine the phosphorylation of GSK-3β. In a separate experiment, PDTC was administered into mice subjected to transverse aortic constriction for 2 weeks.Results  (1)Transverse aortic constriction(TAC) significantly increased the ratio of HW/BW. Two weeks after TAC, the ratio of HW/BW was significantly increased by 48.7%(P<0.01), compared to age-matched sham control. NFkB binding activity and the level of phospho- GSK-3β(Ser9) were significantly increased at 2 weeks following TAC compared to age-matched sham control (P<0.01).(2)Administration of PDTC into TAC mice for 2 weeks, significantly reduced the ratio of HW/BW by 16.4%(P<0.05), compared to non-treated TAC mice. NFkB binding activity was significantly reduced by 34.3% (P<0.01) in the hearts administered with PDTC for 2 weeks, compared to non-treated TAC group.  In addition,administration of PDTC also decreased the level of phospho- GSK-3β(Ser9)/ GSK-3β by 22.1%(P<0.05) compared to non-treated TAC group.Conclusion  PDTC inhibit the NFkB binding activity and the level of phospho- GSK-3β(Ser9) in hypertrophic heart tissues and thereby attenuates the development of cardiac hypertrophy.

  【Key words】  cardiac hypertrophy;pyrrolidine dithiocarbamate;NF-κB;GSK-3β

    心肌肥大是心臟對生物機械牽張和神經體液刺激的一種主要反應。雖然早期心肌肥大是心臟維持有效心輸出量的一種代償性機制,但持久的心肌肥大會導致心臟進入失代償階段,繼而發生不可逆轉的心肌肥大和擴張,心肌收縮力下降,導致心力衰竭[1,2]。調控心肌細胞肥大的詳細分子機制及關鍵的信號轉導通路迄今尚未闡明。最近的研究提示核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路可能在心肌肥大的發生發展中起著重要作用[2,3]。吡咯烷二硫基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate ,PDTC)是NF-κB抑制劑,通過其抗氧化作用可抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)誘導的反應性氧自由基的產生和NF-κB活性[4]。Dechend等也報道抗氧化劑可通過抑制NF-κB活性而解除AngⅡ所誘導的心肌細胞肥大性反應[5]。然而,Hayakawa等報道PDTC抑制NF-κB活性與抗氧化功能無關[6]。為此,本研究以壓力負荷增加誘導的小鼠心肌肥大為模型,進一步探討PDTC抑制NF-κB活性的機制,并觀察PDTC對心肌肥大發生發展的影響。

  1  材料與方法

  1.1  材料  藥品與試劑:水合氯醛、PDTC(Sigma 公司產品);NF-κB寡核甘酸、T4 Polynucleotide kinase、Gel Shift Banding 5xBuffer(Promega公司產品);Pierce BCA蛋白分析試劑(Pierce化學公司產品);[γ-32p]ATP(3000Ci/mmol)(Amersham公司產品);p-GSK3β(Ser9)、 anti-Rabbit IgG HRP-Linked抗體(Cell Signaling公司產品);GSK3β(H-76)(Santa Cruz Biotechnology公司產品);ECL化學發光試劑盒(Amersham,Piscataway,NJ);Kaleidoscope Prestained Standards蛋白質Marker(BIO-RAD公司產品);SDS、丙烯酰胺、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)(Sigma公司產品)。實驗動物:雄性PVB/N小鼠,美國東田納西州大學實驗動物中心提供。

  1.2  方法

  1.2.1  小鼠心肌肥大模型的建立  PVB/N小鼠周齡達6~7周時,經水合氯醛麻醉后,通過氣管插管與嚙齒動物呼吸機連接,進行人工通氣。于胸部左側第2~3肋間打開胸腔,分離主動脈弓并在其下穿一絲線,按統一標準使主動脈縮窄(Transverse aortic constriction,TAC),關閉胸腔。假手術組除了不進行TAC外,其余手術程序完全與模型組相同。

  1.2.2  實驗分組及給藥  實驗分為3組:(1)假手術組:假手術組除了不進行主動脈縮窄外,其余手術程序完全與模型組相同;(2)TAC模型組:縮窄主動脈弓二周;(3)PDTC處理組:小鼠于TAC前1h開始腹腔注射PDTC,劑量120mg·kg-1·d-1,持續2周。

  1.2.3  樣本的收集與檢測  (1)心臟重量/體重比值:TAC 2周后,用水合氯醛麻醉小鼠后,取出心臟,統一標準修剪心臟、稱重,計算心臟重量/體重比值,作為評估心肌肥大的指標。取左心室,-70℃保存待用;(2)胞漿、胞核蛋白的提取:左心室肌組織中加入Buffer A充分勻漿,在冰上放置15~30min,再加入適量的10%NP-40,混勻1min,4℃、10000r/min離心3min,上清即為胞漿蛋白。沉淀用Buffer C懸浮混勻,冰上放置1~2h,不時振動,再在4℃、14,000轉/min離心10min,上清即為核提取物。采用Bradford方法,以BSA作標準測定胞漿和胞核蛋白濃度。胞漿和胞核蛋白提取物于-80℃保存備用;(3)NF-κB活性的檢測:采用凝膠遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)方法。本實驗中NF-κB同序寡核苷酸探針如下:3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5′;5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′,采用T4寡核苷酸激酶法以γ-32P-ATP(3000Ci/mmol)標記探針。核蛋白-DNA探針結合反應體系為:等量核蛋白提取物(30μg),35 fmols[γ-32p]標記的雙鏈NF-κB寡核苷酸,反應總體積為15μl。室溫靜置20min后加入加樣緩沖液,經6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。干膠后,-80℃放射自顯影,圖像采用Bio-Rad公司的phosphor-圖像分析系統進行定量分析。(4)Western blot分析:經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離待測蛋白,并將其轉移至硝纖膜上,用封閉緩沖液(5%脫脂奶粉,0.05%Tween-20 TBS) 封閉1h,然后與相應的特異性抗體孵育,4℃過夜。次日用封閉緩沖液漂洗3次,再與辣根過氧化物酶標記的相應二抗于室溫孵育1h后,用0.05%Tween-20 TBS 漂洗3次。按0.125ml/cm2膜加上化學發光試劑,靜置1~2min后,壓X光片作為顯影記錄。采用phosphor-圖像分析系統,進行定量輝度掃描分析。

  1.2.4  統計學處理  本實驗中所有數據均采用x±s表示,經方差齊性檢驗后,組間分析采用t檢驗。

  2  結果

  2.1  PDTC降低TAC小鼠心臟重量/體重比值  小鼠TAC 2周后,心臟重量/體重比值明顯增加,與假手術對照組相比增加了48.7%[6.78±1.14(mg/g) VS. 4.56±0.34(mg/g),n=10,P<0.01]。PDTC處理組與TAC模型組相比可以使小鼠心臟重量/體重比值下降16.4%[5.67±0.49 (mg/g) VS. 6.78±1.14 (mg/g),n=10,P<0.05]。

  2.2  PDTC降低TAC小鼠心肌組織中NF-κB活性  圖1顯示,小鼠TAC 2周后,心肌組織中NF-κB活性明顯增加,與假手術組相比上升了128.1% (6.16±0.98 VS. 2.70±0.63,n=10,P<0.01],給予PDTC可以抑制心肌組織中NF-κB活性的增加,與TAC模型組相比降低了34.3%(4.05±1.06 VS. 6.16±0.98,n=10,P<0.01),提示PDTC具有抑制壓力負荷誘導的心肌組織中NF-κB活性增加的作用。

  Sham=假手術組,TAC=TAC模型組,TAC+PDTC=PDTC處理組。nb=非特異結合

  圖1  PDTC抑制肥大心肌組織中NF-κB活性 略

  2.3  PDTC對TAC小鼠心肌組織中GSK3β(Ser9)磷酸化的影響  圖2顯示,小鼠TAC 2周后,心肌組織中GSK3β(Ser9)的磷酸化增加,與假手術組相比p- GSK3β(Ser9)/GSK3β比值上升了35.1%(0.77±0.08 vs. 0.57±0.12, n=10,P<0.01)。給予PDTC其p-GSK3β(Ser9)/GSK3β比TAC模型組降低了22.1%(0.60±0.18 vs 0.77±0.08,n=10,P<0.05)。


  圖2  PDTC對心肌組織中p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表達水平的影響 略

  3  討論

  本研究發現縮窄小鼠主動脈弓2周后,其心臟重量/體重比值增加,同時心肌組織中NF-κB的結合活性和GSK3β(Ser9)磷酸化水平增加。給TAC小鼠腹腔注射NF-κB抑制劑PDTC能明顯地抑制心肌組織中NF-κB活性和GSK3β(Ser9)磷酸化水平,并減輕心肌肥大的發展。這些結果表明,PDTC可以通過抑制NF-κB結合活性和GSK3β(Ser9)磷酸化水平延緩心肌肥大的發生發展。

  觸發心肌肥大的反應與多種信號通路的激活有關,包括鈣調神經磷酸酶(Calcineurin)、絲裂素活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase,MAPK) 、鈣離子/鈣調素依賴的蛋白激酶(Calcium calmodulin-dependent protein kinases, CaMK)、磷酸肌醇3-激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/ 蛋白激酶B(PKB, protein kinase B, Akt)和核因子-κB(nuclear factor kappa B ,NF-κB)等[2,3,7]。以體外培養心肌細胞為模型的研究和我們的動物在體實驗表明NF-κB信號通路在心肌肥大的發生發展中起著關鍵作用[2,3,5]。但目前仍不清楚在心肌肥大發生發展過程中NF-κB是如何被激活的。NF-κB是Rel蛋白家族成員,主要由p50和p65(RelA)兩個亞單位組成。NF-κB結構中都有約300個氨基酸組成的Rel同源區,內含與DNA結合、二聚體化及核易位有關的關鍵序列。在絕大多數細胞中,NF-κB二聚體與抑制蛋白IκB結合,以無活性的形式存在于胞漿中。NF-κB p65(RelA)的磷酸化與NF-κB核易位和活化密切相關。近年來的研究發現糖原合成激酶-3β(Glycogen Synthase Kinase-3β,GSK3β)可以影響NF-κB p65(RelA)亞單位的磷酸化,從而抑制NF-κB活化[8]。因此我們推測GSK-3β可以通過調控NF-κB活性而參與心肌肥大的發生發展。在本研究中,我們觀察到縮窄主動脈弓的小鼠心肌組織中,NF-κB的結合活性顯著升高,同時GSK3β(Ser9)磷酸化水平也明顯增加。Hardt等也發現GSK3β激酶在正常情況下,可抑制細胞的生長,當GSK3β Ser9被磷酸化后,GSK3β激酶的活性降低,從而解除其對細胞生長的抑制作用而促進心肌肥大的發展[9]。

  PDTC是具有抗氧化作用的穩定化合物,被廣泛用于抑制NF-κB活性,但其抑制NF-κB激活的機制尚未闡明。有研究報道PDTC通過其抗氧化作用抑制NF-κB活性[4,5],但Hayakawa等報道PDTC抑制NF-κB活性與抗氧化功能無關[6]。本研究發現PDTC能同時抑制心肌組織中NF-κB活性和GSK3β(Ser9)磷酸化水平,并使心臟重量/體重比值回降,這提示PDTC可以通過抑制NF-κB結合活性和GSK3β(Ser9)磷酸化水平延緩心肌肥大的發生發展。由于GSK-3β激酶可以影響NF-κB p65(RelA)的磷酸化,從而抑制NF-κB活化[8],因此PDTC可能通過抑制GSK3β(Ser9)磷酸化使GSK3β激酶的活性增加,從而抑制NF-κB活性并延緩心肌肥大的發生發展。當然其確切機制還需進一步的研究來證實。

  【參考文獻】

  1  Gupta S, Purcell NH, Lin A,et al. Activation of nuclear factor-kappa B is necessary for myotrophin-induced cardiac hypertrophy. J Cell Biol,2002,159:1019-1028.

  2  Purcell NH, Molkentin JD. Is nuclear factor B an attractive therapeutic target for treating cardiac hypertrophy.Circulation,2003,108:638-640.

  3  李躍華,哈團柱,陳琪,等.MyD88依賴性NF-κB信號途徑在心肌肥大發生過程中的調控作用. 中華醫學雜志,2005,85:267-272.

  4  Sarkar A, Sreenivasan Y, Ramesh GT, et al. Beta-D-glucoside suppresses tumor necrosis factor-induced activation of nuclear transcription factor kappa B but potentiates apoptosis. J Biol Chem,2004,279:33768-81.

  5  Dechend R, Fiebeler A, Park JK,et al.Amelioration of angiotensin II-induced cardiac injury by a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor.circulation,2001,104:576-581.

  6  Hayakawa M, Miyashita H, Sakamoto I, et al.Evidence that reactive oxygen species do not mediate NF-kappa B activation.EMBO J,2003,22:3356-66.

  7  Molkentin JD,Dorn II GW.Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev Physiol,2001,63:391-426.

  8  Buss H, Dorrie A, Schmitz ML, et al.Phosphorylation of serine 468 by GSK-3beta negatively regulates basal p65 NF-kappa B activity. J Biol Chem,2004,279:49571-49574.

  9  Hardt SE,Sadoshima J. Glycogen synthase kinase-3: a novel regulator of cardiac hypertrophy and development. Circ Res,2002,90:1055-1063.

  作者單位: 210029 江蘇南京,南京醫科大學病理生理學系

  (編輯:秋  實)

 


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