當前位置:Home > 醫源資料庫 > 在線期刊 > 中華醫學研究雜志 > 2005年第5卷第12期 > 魚金抑制乙型流感病毒誘導細胞凋亡研究

魚金抑制乙型流感病毒誘導細胞凋亡研究

來源:中華醫學研究雜志 作者:楊慧,楊斌,孫堅,何士勤,俞紅,周南進,李劍琦,冷 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 探討魚金注射液阻斷乙型流感病毒誘導狗腎傳代細胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)凋亡。方法 采用瑞氏染色法光鏡下觀察細胞形態變化、原位末端標記術測定細胞凋亡率。結果 病毒感染組MDCK細胞凋亡百分率顯著高于其他組(P0。試驗組、藥物對照和細胞對照組比較無差異(P0。...


    【摘要】  目的  探討魚金注射液阻斷乙型流感病毒誘導狗腎傳代細胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)凋亡。方法  采用瑞氏染色法光鏡下觀察細胞形態變化、原位末端標記術測定細胞凋亡率。結果  病毒感染組MDCK細胞凋亡百分率顯著高于其他組(P<0.001);試驗組、藥物對照和細胞對照組比較無差異(P>0.05);原位末端標記組細胞凋亡顯著高于瑞氏組(P<0.01)。結論  該研究提示乙型流感病毒可誘導MDCK細胞凋亡,而魚金能阻斷乙型流感病毒誘導MDCK細胞凋亡。

  【關鍵詞】  乙型流感病毒;MDCK細胞;細胞凋亡;魚金;TUNEL

  A study on Yu Jin against cell apoptosis induced by influenza virus B

  YANG  Hui,YANG Bin,SUN Jian,et al.

  Medical Research Institute of Jiangxi Province ,Nanchang 330006,China

  【Abstract】  Objective  To investigate inhibitory effects of Yu Jin on the apoptosis induced by influenza virus B in MDCK(Madin-Darby canine kidney) cells.Methods  The morphological changes of apoptotic cells under light microscopy . Influenza virus B induced apoptotic cell percentage was calculated through two methods:terminal deoxynucleotidy/ transgerase-mediated duTP nick end labeling(TUNEL) and Wright staining.Results  The percentage of MDCK cells apoptosis of virus content was significantly higher than that of Yu Jin and virus combined treated group cell control and drug control (P<0.01).While no significant difference was shown among the two latter(P>0.05) all in the Wright and TUNEL.The percentage of MDCK cells apoptosis of TUNEL was significantly higher than that Wright (P<0.01).Conclusion  This study suggested that Yu Jin could against the apoptosis induced by influenza virus B. The TUNEL test is more useful than that of Wright test.

  【Key words】  apoptosis;influenza virus B;Yu Jin;TUNEL

    魚金注射液是金銀花和魚腥草為主要成分的中藥制劑。金銀花又名忍冬花、銀花和金花等,屬忍冬科植物。花主含木犀草素及皂甙。業已證明金銀花組合劑可滅活流感病毒。魚腥草又名野花麥和臭菜等,為三白草科植物。全草主含魚腥草和甲基正壬基酮。研究表明可抗流感病毒[1,2]。1993年Tak-Zawa等[3]首次報道甲型流感毒可誘導MDCK和Hela細胞凋亡。近年乙型流感流行有抬頭的趨勢[4],并已證明該病毒可誘導MDCK細胞凋亡。此研究首次報告魚金能抗乙型流感病毒誘導MDCK細胞凋亡。

  1  材料與方法

  1.1  主要試劑和器材 

  24孔、96孔組織培養板和50ml組織培養瓶(costar公司)。移液器(Glison公司)。RPM—1640基礎液(Gibco公司)。牛血清白蛋白、多聚賴氨酸和胰蛋白酶(sigma公司)。胎牛血清和瓊脂糖(USA)。末端脫氧核苷酸轉移酶介導ixdUTP缺口末端標記試劑(TUNEL)S|有限公司、批號99091822,主要成分為魚腥草和金銀花,每1ml含甲荃正壬酮不低于24μg,有效成分還有芳樟醇等二十多種。

  1.2  制備病毒和MDCK細胞 

  B/南昌/495/97病毒株由江西醫學院微物生教研室分離,經世界衛生組織和美國疾病控制中心鑒定。將病毒接種于MDCK細胞,35℃孵育48~96h,收獲病毒,取上清液行血凝試驗[4],血凝滴度大于1∶64的混勻后分裝存于-70℃備用。MDCK細胞來自美國;培養液為RPM—1640,加10%胎牛血清,40U/ml的慶大霉素及2μg/ml的兩性霉素,細胞濃度為1×105/ml,接種于培養板或培養瓶中,37℃ 5%CO2孵育,長成單層后備用。

  1.3  測定病毒半數感染量(EID50) 

  根據文獻[5]的方法檢測和計算。

  1.4  測定魚金制劑液細胞毒性限量試驗 

  取形成單層的MDCK細胞96孔板,用細胞維持液將魚金注射液作系列兩倍稀釋后分別加入細胞孔中,每個稀釋度三孔。另設維持液對照組。每天觀察細胞病變,共觀察1周,以無細胞病變孔為藥物的毒性限量濃度。以1/2的藥物毒性量為試驗濃度。

  1.5  魚金制劑抗流感病毒誘導MDCK細胞凋亡試驗 

  試驗分為4組:(1)正常細胞對照組、加細胞維持液。(2)病毒對照組,加病毒液。(3)藥物對照組,加藥物。(4)試驗組,同時加藥液和病毒液。將長成單層的細胞瓶用PBS洗三次,分別接種上述各組不同的液體入細胞瓶內,35℃、5%CO2孵育,觀察細胞,孵育22h。分別收集各組細胞,進行瑞氏染色,原位末端標記試驗。

  1.6  瑞氏染色 

  分別將各組細胞進行涂片、固定和染色后在顯微鏡下觀察,每組計數500個細胞,計算細胞凋亡率。

  1.7  原位末端標記試驗(Teriminal deoxynacleotidy TdT. TdT—mediated DUTP Nick end labeling, TUNEL) 

  方法見試劑盒說明書。結果判斷,具有凋亡細胞特征并染呈棕色的細胞為陽性細胞,無凋亡細胞特征并染呈淡黃色的細胞為陰性細胞。每組計數500個細胞,計算細胞凋亡率。

  2  結果

  2.1  流感病毒EID50測定結果 

  EID50為6.0、使用1000EID50。

  2.2  藥物毒性限量濃度測試結果 

  藥物毒性限量濃度測試結果:0.15μg/ml,藥物試驗濃度為0.075μg/ml。

  2.3  細胞形態學試驗結果 

  以瑞氏染色,在光學顯微鏡下觀察,可見病毒感染組細胞出現,染色質凝集在核膜周圍,呈新月形、花瓣狀、胞體縮小、胞膜皺折等細胞凋亡的特征,如圖1。各組細胞凋亡率計算結果見表1。

  2.4  原位末端標記試驗結果 

  在普通光學顯微鏡下,可見具有凋亡細胞特征的細胞染呈棕色如圖2。各試驗組細胞凋亡率計算結果如表1。表1  MDCK細胞凋亡率的測定結果(略)注:※病毒組與試驗組比較

  3  討論

  本研究證明乙型流感病毒可誘導MDCK細胞凋亡,此結果與文獻[4]報道相同。有關細胞凋亡的機理待探討。

  采用原位末端標記術和瑞氏染色法,測試各組細胞凋亡率,發現試驗組細胞凋亡率分別為3.52±0.16和4.20±0.18,病毒感染組分別為56.72±3.02和35.50±2.03,兩率比較差異均有顯著性(P<0.01),而試驗組與藥物和細胞對照組比較無差異(P>0.05)。結果證明魚金注射液有抗乙型流感病毒誘導MDCK細胞凋亡的作用,暗示了魚金藥液阻斷了病毒的復制。病毒不能復制其機制有待進一步研究。上述結論與臨床報告魚腥草可抗流感相吻合[2]。因此本研究為臨床擇定魚金防治流感提供了新實驗依據。原位末端標記術測試細胞凋亡率為56.72±3.02,而瑞氏染色法為35.50±2.03。兩率比較有差異(P<0.05),說明原位末端標記法優于瑞氏染色法。前法是將滲入到凋亡細胞中的外源性核苷酸在酶催化下與凋亡細胞內源性核酸酶激活而產生DNA鏈相結合,并通過顯示系統顯示出現,不但可檢測出早期凋亡細胞,并且可增加特異性和敏感性[5]。不需要昂貴器材,使用普通顯微鏡觀察,染色片能長期保留,適合普及。所以原位末端標記術具有推廣應用的價值,尤其在研究抗病毒藥效中,有助于從細胞基因調控的角度深入探討。

  【參考文獻】

  1  江蘇醫學院編.中藥大辭典.上海:上海科學技術出版社,1997,1403-1439.

  2  李文,王少軍,嚴敏,等.魚腥草提取液抗流感,腮腺炎病毒效果觀察.預防醫學文獻信息,1999,5(4):347-348.

  3  Takieuusa T, Matsukawas, Higuchiy, et al. Induction of programmed cell death (apoptosis) by influenza virus infection in tissue culture cells.J Gen Virol,1993,74:2347-2355.

  4  孫堅,王農榮,陳世仲,等.穿琥寧抑制流感病毒誘導狗腎傳代細胞調亡. 中國醫院藥學雜志, 2003, 23(7):405-407.

  5  黃貞祥,洪濤,劉崇柏,等.醫學病毒學實驗基礎及實驗技術.北京:科學出版社,1990,109-474.

  作者單位: 1 330006 江西南昌,江西省醫科所

        2 330003 江西南昌,江西醫學院第四附屬醫院

        3 330006 江西南昌,江西醫學院

  (編輯:秋  實)

 


醫學百科App—醫學基礎知識學習工具


頁:
返回頂部】【打印本文】【放入收藏夾】【收藏到新浪】【發布評論



察看關于《魚金抑制乙型流感病毒誘導細胞凋亡研究》的討論


關閉

網站地圖 | RSS訂閱 | 圖文 | 版權說明 | 友情鏈接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 醫源世界 版權所有
醫源世界所刊載之內容一般僅用于教育目的。您從醫源世界獲取的信息不得直接用于診斷、治療疾病或應對您的健康問題。如果您懷疑自己有健康問題,請直接咨詢您的保健醫生。醫源世界、作者、編輯都將不負任何責任和義務。
本站內容來源于網絡,轉載僅為傳播信息促進醫藥行業發展,如果我們的行為侵犯了您的權益,請及時與我們聯系我們將在收到通知后妥善處理該部分內容