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血管內皮生長因子在先兆子癇大鼠腎損傷中的作用

來源:中華醫學研究雜志 作者:蘇華,朱忠華,鄧安國 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 研究血管內皮生長因子(VEGF)在先兆子癇大鼠腎損傷中的作用。方法 采用一氧化氮合酶抑制劑復制大鼠先兆子癇模型,通過雙抗酶聯免疫吸附法檢測血漿及尿液中VEGF含量,應用原位雜交法測定腎小球VEGFmRNA轉錄水平,利用免疫組化法檢測腎小球VEGF蛋白表達情況。結果 在先兆子癇大鼠中,尿液中VEGF含量(以尿V......


    【摘要】  目的  研究血管內皮生長因子(VEGF)在先兆子癇大鼠腎損傷中的作用。方法  采用一氧化氮合酶抑制劑復制大鼠先兆子癇模型,通過雙抗酶聯免疫吸附法檢測血漿及尿液中VEGF含量,應用原位雜交法測定腎小球VEGFmRNA轉錄水平,利用免疫組化法檢測腎小球VEGF蛋白表達情況。結果  在先兆子癇大鼠中,尿液中VEGF含量(以尿VEGF/尿肌酐表示)升高且與腎臟局部VEGF的表達強度呈正相關,腎小球局部VEGFmRNA和VEGF蛋白表達均增強,且表達的強度與24h尿蛋白排泄量呈正相關。結論  尿液VEGF可能來源于腎臟局部的分泌,腎小球VEGF可能參與了先兆子癇中大量蛋白尿的產生。

  【關鍵詞】  血管內皮生長因子;先兆子癇;蛋白尿

  The effect of vascular endothelial growth factor in kidney lesion of rat with preeclampsia

  SU Hua,ZHU Zhong-hua,DENG An-guo.

  Department of Nephrology,Xiehe Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022,China

  【Abstract】  Objective  To investigate the effect of vascular endothelial growth factor(VEGF) in kidney lesion of rats with preeclampsia.Methods  A rat model of preeclampsia was developed by inhibitor of nitric oxide synthase. Plasma and urinary VEGF were determined using a sandwich enzyme immunoassay. The level of VEGFmRNA in glomeruli was measured by in situ hybridization. The expression of VEGF protein in glomeruli was detected by immunohistochemistry method.Results  In rats with preeclampsia, urinary VEGF levels (expressed as VEGF/creatinine ratio) were significantly higher and positively correlated to the expression of VEGF in glomeruli, the level of VEGF mRNA and the expression of VEGF were significantly higher than other groups. There was a positive correlation between the expression of VEGF in glomeruli and 24 h urinary protein excretion.Conclusion  Corrected urinary VEGF levels can stand for the expression of VEGF in glomeruli. VEGF in glomeruli might be involved in the mechanism of proteinuria in preeclampsia.

  【Key words】  vascular endothelial growth factor; preeclampsia; proteinuria

    先兆子癇是引起孕產婦及圍生兒死亡的重要原因,腎臟損傷所致的大量蛋白尿為其主要的臨床表現。引起腎小球濾過膜通透性增高的原因目前不詳。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種強效的增強血管壁通透性的生物活性物質[1]。有研究表明血漿及胎盤蛻膜局部VEGF水平的改變可能與妊高征的發病有關。但血漿、尿液VEGF水平與腎臟局部VEGF表達的關系及腎臟局部VEGF的表達與先兆子癇腎損傷的關系至今國內外尚未有研究。本試驗擬通過一氧化氮合酶抑制劑——亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-nitro-arginine,L-NAME)復制大鼠先兆子癇模型[2],檢測血漿、尿液中VEGF濃度,觀察腎小球中VEGF的表達及其表達的強弱與24h尿蛋白排泄量的關系,從而探討VEGF在先兆子癇腎損傷中的作用。

  1  材料與方法

  1.1  主要試劑與儀器 

  L-NAME(美國Sigma公司),VEGF Elisa試劑盒(北京中山生物有限公司),地高辛標記的VEGFmRNA探針(德國Biognostik公司),VEGF多克隆抗體(Santa Cruz公司),SABC試劑盒(武漢博士德生物制品公司),大鼠尾動脈袖帶式血壓計(由同濟醫學院心血管研究中心提供),透射電鏡(由同濟醫學院超微病理學教研室提供),計算機病理圖像分析儀(由同濟醫學院清屏影像公司提供)。

  1.2  動物模型復制與分組 

  取200~250g普通級Wistar雄性大鼠50只和成年Wistar雄性大鼠25只(由同濟醫學院實驗動物學部提供),按雌:雄=2:1比例同籠混合飼養一夜后,次日清晨當雌性大鼠陰道涂片檢查可見活動的精子時,確認為大鼠妊娠第1d。將孕鼠隨機分為兩組,A組:先兆子癇模型組(n=6),B組:正常妊娠對照組(n=6)。另取6只無妊娠史雌性大鼠作為C組,即未孕L-NAME處理組。從妊娠第18d開始對A組和B組大鼠分別皮下注射L-NAME和蒸餾水250mg/(kg·d),持續4d后于妊娠第22d時處死。C組大鼠于皮下注射L-NAME 250mg/(kg·d),持續4d后處死。

  1.3  24h尿蛋白排泄量的測定 

  用標準代謝籠分別與注射前和注射第2、4d收集各組大鼠24h尿液,采用考馬斯亮藍結合法測定24h尿蛋白排泄量。

  1.4  收縮期血壓的測定

  A組和C組大鼠于L-NAME注射前及L-NAME注射第2、3、4d測量尾動脈收縮壓。具體方法是將大鼠置于預熱箱內預熱至38℃~40℃,待其安靜后用大鼠尾動脈血壓儀在5min內連續測量3次收縮期血壓,取平均值。

  1.5  血漿及尿液標本的采集與檢測 

  在注射第4天時經眼靜脈竇采集各組大鼠靜脈血2ml,置于經肝素抗凝的玻璃管,3000r/min離心10min后取上清液,置于-70℃冰箱保存待檢。大鼠處死后經膀胱穿刺收集各組大鼠尿液,3000r/min離心10min取上清3ml存放于-70℃冰箱保存待檢。采用雙抗酶聯免疫吸附法(ELISA),通過繪制標準曲線求出標本VEGF的濃度,為了糾正尿液濃度不同的影響,尿液VEGF含量以尿VEGF/尿肌酐(ng/mmol Cr)來表達。

  1.6  原位雜交法 

  大鼠處死后,取一側腎組織將其置于4%多聚甲醛液1~2h、脫水、透明、浸蠟、包埋、連續切片后,具體操作步驟按VEGFmRNA 原位雜交試劑盒說明書進行。實驗設不加探針的陰性對照。顯微鏡下胞漿呈黃色顆粒狀為陽性。

  1.7  免疫組織化學法
 
  VEGF蛋白用免疫組織化學法檢測,具體操作步驟見試劑盒說明書。實驗均設不加一抗的陰性對照。顯微鏡下胞漿呈棕黃色顆粒狀者為陽性,蛋白表達強弱用吸光度(absorbance,A)表示。每張切片隨機選取5個腎小球,用免疫組化分析軟件(HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統)計算VEGF陽性著色細胞吸光度。

  1.8  統計學方法 

  實驗數據以x±s表示,組間數據差異的顯著性分析,方差齊者采用t檢驗,方差不齊時采用t’檢驗。

  2  結果

  2.1  24h尿蛋白排泄量 

  A組大鼠L-NAME注射第2d時24h尿蛋白排泄量[(35.16±11.31)mg/24h]較注射前[(4.52±1.00)mg/24h]增高,注射第4d時24h尿蛋白排泄量[(55.41±20.25)mg/24h]更高,P均<0.01。注射前各組大鼠24h尿蛋白排泄量間無統計學差異(P>0.05)。注射后,同一時間段內,A組大鼠24h尿蛋白排泄量較B組(P<0.01)及C組(P<0.01)有顯著性增高,見表1。表1  各組大鼠24h尿蛋白排泄量(略)注:與A組比較*P<0.01,與注射前比較△P<0.01

  2.2  收縮期血壓 

  A組和C組大鼠注射L-NAME后,血壓進行性上升。注射前兩組大鼠血壓間無統計學差異(P>0.05)。注射L-NAME后,同一時間點上,A組大鼠血壓明顯高于C組,兩組間有顯著的統計學差異(P<0.01),見表2。表2  A組和C組大鼠收縮期血壓(略)注:與C組比較P<0.01

  2.3  血漿、尿液及腎臟局部VEGF的表達水平 

  A組大鼠血漿及尿液VEGF含量顯著高于B組和C組(P<0.05)。A組大鼠腎小球內VEGF mRNA轉錄水平較B組和C組升高。而且A組腎小球局部VEGF蛋白的表達(A=0.352±0.021)較B組(A=0.323±0.134)和C組(A=0.325±0.014)增強,差異均有顯著性(均為P<0.05),見表3。各組大鼠VEGF主要表達于足細胞及集合管上皮細胞,VEGF的分布在各組間無差異。表3  血漿、尿液及腎臟局部VEGF的表達水平(略) 注:與A組比較,*P<0.05

  2.4  相關分析 

  本研究表明尿液中VEGF的含量(ng/mmol Cr)與腎小球局部VEGF蛋白表達的強度呈正相關(r=0.79,P<0.01);腎小球局部VEGF蛋白表達的強度與24h尿蛋白排泄量呈正相關(r=0.84,P<0.01);尿液VEGF水平與血漿VEGF水平無相關性(r=0.47,P>0.05);血漿VEGF的水平與腎臟局部VEGF的表達強度無相關性(r=0.28,P>0.05)。

  3  討論

  3.1  VEGF的生物學特性 

  VEGF是一46ku的肝素結合糖蛋白,它具有促進內皮細胞有絲分裂、誘導單核巨噬細胞趨化與激活等多種生物功效,但它最主要的功能是增強血管壁的通透性。VEGF增強血管通透性的能力,以摩爾為單位計算,是組織胺的50000倍左右。在腎臟中,腎小球臟層上皮細胞(足細胞)是產生VEGF的主要部位。

  3.2  VEGF與先兆子癇腎損傷 

  本實驗成功地復制了大鼠先兆子癇模型。于大鼠妊娠第18d開始經皮下注射L-NAME 250mg/(kg·d),持續4d,該模型組大鼠的24h尿蛋白排泄量、收縮期血壓較正常妊娠組及未孕L-NAME處理組均有顯著升高。同時我們還觀察到先兆子癇模型組大鼠大腿內側呈凹陷性水腫。以上各項指征及大鼠腎臟病理形態學改變與Molnar等[2]的報道類似。

  通過原位雜交技術及免疫組化技術,我們發現在大鼠先兆子癇模型中,VEGFmRNA 及VEGR蛋白的表達較正常妊娠組及未孕L-NAME處理組均有顯著增強。但它們在腎組織中的分布與正常者相比無改變。先兆子癇模型中,腎小球VEGF表達增強,這可能是由缺氧所誘導的。因為妊高癥最基本的病變為全身小動脈痙攣,這將導致全身各臟器,包括腎組織缺血、缺氧,而許多研究均證實在缺氧狀態下,VEGF的表達是上調的[1]。另外,與先兆子癇發病相關的各種因素,如牽拉力、AngⅡ和一系列細胞因子,也可使VEGF表達上調[1]。

  在腎小球中,足細胞分泌的VEGF以旁分泌的方式作用于腎小球毛細血管內皮細胞上的VEGFR發揮其增強血管壁通透性的效能[3]。另外VEGF與腎小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)[4]有著高度的親和力,可與GBM中富含陰離子的硫酸肝素蛋白多糖發生作用,導致基底膜陰離子位點的減少[5]。因此VEGF可通過減少腎小球基底膜陰離子的數目[5]以及誘導內皮細胞小窗的形成[6],上調參與循環大分子跨內皮轉運的囊泡(vesicular vacuolar organelle, VVO)的功能[7],增強內皮細胞膠原酶的表達和活性,促進膠原降解[8]等多條途徑同時影響腎小球濾過膜的電荷屏障和機械屏障。VEGF表達的異常增強可以引起腎小球濾過膜對血漿蛋白的通透性增加,導致蛋白尿的形成。VEGF在蛋白尿中的作用已被大量研究證實。Horita等[9]報道在牛血清白蛋白誘導的蛋白超負荷腎病變中以及Bailey等[10]發現在微小病變腎病患者中,VEGF在腎小球中的表達上調且與蛋白尿的嚴重呈正相關。Kanellis等[11]報道在嘌呤核苷腎病及被動型Heymann腎炎中VEGFmRNA表達上調,且先于蛋白尿的發生,參與了腎小球損傷的發生發展。Lenz T等[12]發現在2型糖尿病患者中,尿VEGF濃度與尿蛋白排泄量呈正相關。

  在本實驗中,我們發現尿液VEGF水平與腎臟局部VEGF表達強度呈正相關,而與血漿VEGF的濃度無相關性,并且血漿VEGF水平與腎臟VEGF的表達強度也無相關性,這提示,尿液中的VEGF主要來源于腎臟局部的分泌,它可以作為反映腎臟局部VEGF表達的一易于檢測的指標。本研究還發現先兆子癇大鼠腎臟局部VEGF表達的強弱與蛋白尿的嚴重程度呈正相關,這提示腎小球VEGF可能參與了先兆子癇中蛋白尿的發生。關于腎小球VEGF在先兆子癇腎損傷大量蛋白尿的產生中究竟起到多大的作用及其作用機制還需利用VEGF特異性的拮抗劑及其他方法作進一步研究,以期為臨床防治先兆子癇中腎臟的損傷提供線索。

  【參考文獻】

  1  Ferara N. Vascular endothelial growth factor : basic science and clinical progress. Endocrine REV, 2004,25: 581-611.

  2  Molnar M,Suto T,Toth T,et al. Prolonged blockade of nitric oxide synthesis in gravid rats produces sustained hypertension, proteinuria, thrombocytopenia, and intrauterine growth retardation. Am J Obstet Gynecol,1994,170:1458.

  3  Simon M,rockl W, Hornig C ,et al. Receptors of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor (VEGF/VPF) in fetal and adult human kidney. J Am Soc Nephrol, 1998, 9:1032.

  4  cooper ME,Vranes D, Youssef S ,et al. Increased renal expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and its receptor VEGFR-2 in experimental diabetes. Diabetes,1999,48:2229.

  5  Maruyama K, Tomizama S, Shimabnknro N ,et al. Effect of supernatants derived from T lymphocyte culture in minimal change nephrotic syndrome on rat kidney capillaries. Nephron, 1989,52:73.

  6  Roberts WG, Palade GE. Increased microvascular permeability and endothelia fenestration induced by vascular endothelial growth factor. J Cell Sci,1995,18,08:2369.

  7  Qu H,Nagy J A, Sanger D R ,et al. Ultrastructural localization of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) to the abluminal plasma membrane and vesicular vacuolar organelles of tumor microvascular endothelium. J Histochem Cytochem, 1995, 43:381.

  8  Unemori E N,Ferrara N,Bauer E A ,et al. Vascular endothelial growth factor induces interstitial collagenase expression in human endothelial cells. J Cell Physol,1992,153:557.

  9  Horita Y,Miyazaki M, Koji T ,et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in rats with protein-overload nephrosis. Nephrol Dial Transplant,1998,13:2519.

  10  Bailey E,bottom M J,Westwell S ,et al. Vascular endothelial growth factor mRNA in minimal change membranous and diabetic nephropathy demonstrated by nonisotopic in situ-hybridization.J Clin Pathol,1999,52:735.

  11  Kanellis J,Levidiotis V,Khong T,et al. A study of VEGF and its receptors in tux rat models of proteinuria. Nephron Physiol, 2004, 96(1):26-36.

  12  Lenz T, Haak T, Malek J,et al. Vascular endothelial growth factor in diabetic nephropathy. Kidney Blood Press Res,2003,26:338-343.

  *基金項目:湖北省自然科學基金資助項目(NO.2000J055)

  作者單位: 430022 湖北武漢,華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院腎內科

  (編輯:李  令)

 


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