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類天皰瘡的臨床特征與其靶抗原關系的研究

來源:中華醫學研究雜志 作者:金巖,黃懿,成揚,付海軍 2006-8-19

摘要: 【摘要】 對56例江浙滬地區類天皰瘡患者的臨床特征和不同靶抗原的關系進行了探討,發現類天皰瘡多發于老年人,并以大皰性多見。在BP的急性期抗體結合230kD、230/180kD、合并條帶靶抗原較常出現(86。而在疾病的緩解期抗體結合180kD抗原較常出現(65%)。180kD靶抗原并非次要抗原。...


    【摘要】  對56例江浙滬地區類天皰瘡患者的臨床特征和不同靶抗原的關系進行了探討,發現類天皰瘡多發于老年人,并以大皰性多見;在BP的急性期抗體結合230kD、230/180kD、合并條帶靶抗原較常出現(86.11%);而在疾病的緩解期抗體結合180kD抗原較常出現(65%);180kD靶抗原并非次要抗原。

  【關鍵詞】  類天皰瘡;臨床特征;靶抗原

  Study on the clinical characters and immunol-blot patterns of bullous pemphigoid

  JIN Yan,HUANG Yi,CHENG Yang,et al.

  Dongfang Hospital Affiliated to Tongji University,Shanghai 200120,China

  【Abstract】  56 cases of bullous pemphigoid(BP) were studied on the clinical characters and immunol-blot patterns.It was found that bullous pemphigoid happened mostly among old people in bullous type;Autoantigen BP230,BP230/180 and BP 230/180 combined with minor antigens involved in acute phase of BP patient;While BP180 involved mainly in the remission of the disease.Autoantigen BP180 were not minor antigen.

  【Key words】  bullous pemphigoid;clinical characters;autoantigen

    大皰性類天皰瘡(BP)是一種發生于老年人的自身免疫性大皰病,臨床表現為全身泛發性、張力性大皰,尼氏征陰性,病程反復遷延,嚴重威脅患者的生命健康。BP血清中有多種抗皮膚基底膜不同成分的抗體,有靶抗原分子量為230kD、200kD、180kD、140kD、100kD等,為了進一步探討BP的臨床特征和其靶抗原的關系,我們擬對臨床收集的56例病例及其免疫印跡的結果綜合分析。

  1  材料與方法

  1.1  臨床資料

  1.1.1  研究對象 

  選擇1999年12月~2001年12月華山醫院皮膚科和東方醫院門診、病房就診的江、浙、滬地區漢族類天皰瘡患者,根據臨床表現、組織病理和直接免疫熒光檢查,符合診斷標準確診。

  1.1.2  方法 

  我科專病門診、病房大皰病患者,常規做病理活檢,手術時將切下的組織塊分為兩份,一份做常規組織病理檢查,另一份做直接免疫熒光檢查;確診的BP患者抽取外周新鮮血5ml,留血清-20℃凍存用于測定BP抗原分子量;除對患者的一般情況如年齡、性別、發病時間等進行記錄外,并根據以下內容對BP病例進行登記、隨訪。(1)臨床類型:根據臨術表現將BP分為大皰性、小皰性、局限性和癢疹性等。(2)黏膜損害情況:①有黏膜損害;②無黏膜損害。(3)癢感:①有明顯癢感;②無明顯癢感。(4)病情:①重度:指不斷出現張力性水皰和顯著紅斑,累及體表面積50%以上;②中度:指皮損面積在20%~50%之間;③輕度:皮疹散在分布或局限在身體某一部位,皮疹面積在20%以下。(5)病期:①活動期:指患者不斷出現張力性水皰和顯著紅斑;②穩定期:無明顯水皰發生,只有陳舊皮損。

  1.2  皮膚表皮抗原的提取

  1.2.1  材料

  1.2.1.1  組織 

  取新鮮外科截肢手術皮膚6cm×6cm數塊。

  1.2.1.2  主要試劑及儀器 

  三羥甲基氨基甲烷(TRIS,FARCO產品);苯甲基磺酰氟(PMSF,Promega產品);依地酸鈉(EDTA,Sigma產品);蛋白酶抑制劑(pepstatin,antipain,leupeptin,chymostotin,Sigma公司產品);十二烷基硫酸鈉(SDS,日本進口分裝);高速低溫離心機(HITACHI,日本進口);751型分光光度計(上海第三分析儀器廠);熱分離緩沖液;12.5mmol TRIS-HCl,pH6.8,100μl PMSF(熱分離前加);表皮提取液:2%SDS,65mmol TRIS-HCl,pH6.8,20mmol PMSF,10mmol EDTA,含四種蛋白酶抑制劑(熱分離前加)。

  1.2.2  方法 

  (1)新鮮外科手術皮膚標本,用圖釘固定在木板上,用手術刀除皮下脂肪組織,削真皮至0.5mm厚,冷生理鹽水反復沖洗。(2)熱分離緩沖液分兩份,一份置37℃水浴,另一份置56℃水浴,10min備用。(3)將皮膚剪成2cm×2cm大小,放入37℃熱分離緩沖液20min,再迅速放入56℃熱分離緩沖液中40s,取出冷卻,用手術刀背輕輕分離表真皮。(4)表皮按25~30cm2比1ml的比例加入表皮提取液中,放入組織勻漿器內勻漿(勻漿器放冰中)。(5)勻漿液置塑料管中,于液氮中反復凍融3次,每次10min,后12000rpm離心,4℃,30min,取上清即為表皮提取液,-40℃保存。 (6)751分光光度計測定表皮抗原提取液蛋白含量,在595nm處測OD值,參照標準蛋白(小牛血清白蛋白),計算樣品中蛋白含量。

  1.3  SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

  1.3.1  材料 

  (1)表皮抗原提取液;(2)主要試劑及儀器丙烯酰胺(acrylamide,Fluka產品);甲叉丙烯酰胺(N,N’-Methylenebis-acrylamide,Fluka產品);四甲基已二胺(TEMED,Promega產品);過硫酸胺(APS,華美公司產品);次高分子量標準分子蛋白(上海生化所產品);甘氨酸(Gly,上海試劑三廠,分析純);三羥甲基氨基甲烷(TRIS,FARCO產品);2-巰基乙醇(2-ME,Fluka產品);垂直電泳槽(上海精益有機玻璃制品廠);穩流穩壓電泳儀(丹陽無線電一廠);聚丙烯酰胺母液(Acr-Bis,丙烯酰胺30g,甲叉丙烯酰胺0.8g,雙蒸水加至100ml,磁力攪拌溶解,過濾,置棕色瓶4℃保存);濃縮膠(Acr-bis 0.6ml,0.5M pH6.8 1.25ml,雙蒸水3.1ml,10%SDS 0.05ml,10%APS 0.025ml,TEMED 5μl);分離膠(Acr-Bis 2.3ml,1.5M pH8.8 Tris-HCl 2.5ml,雙蒸水5ml,10%SDS 0.1ml,10%APS 0.1ml,TEMED 10μl);電泳緩沖濃縮液(Tris 15g,Gly 7.2g,SDS 5g,雙蒸水加至500ml,過濾,使用時1∶10稀釋);樣品液(12mM Tris-HCI pH6.8,含20%甘油,10%SDS,10%2-ME,溴酚藍適量)。表皮提取液與樣品液1∶1混合,用時煮沸;固定液(500ml無水乙醇,100ml冰醋酸,400ml雙蒸水);脫色液(250ml無水乙醇,80ml冰醋酸,加雙蒸水至1000ml);染色液(考馬斯亮蘭0.29g,加250ml脫色液,棕色瓶4℃保存)。

  1.3.2  方法

  1.3.2.1  SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 

  將干凈的長短玻璃板用橡皮圈套好,放入垂直電泳槽,螺母固定,底邊縫隙用1%瓊脂封閉,配制分離膠,輕倒入兩玻璃板間空隙內,再加入少量含正丁醇雙蒸水,將分離膠壓平,靜置,過夜,倒去水,配制濃縮膠,輕倒入分離膠上方空隙內,插入塑料梳,靜置3h。輕取塑料梳,分別加入標準品和樣品,兩側水槽內加入電泳緩沖液,100V,1h,再160V 3~4h。

  1.3.2.2  顯色 

  將電泳好的凝膠小心取出,放入固定液中,置搖床上搖動1h;再將凝膠放入染色液中,56℃,搖動10min;再放入脫色液中,搖動過夜。最后觀察凝膠上抗原蛋白的分離效果確定是否轉印。

  1.3.2.3  蛋白質抗原分子量的測定 

  在一定的分子量范圍內,蛋白質的泳動率和分子量的對數呈直線關系。

  在實際測定時,可先測量標準蛋白質自分離膠起點至區帶中線距離做橫軸坐標,然后將標準蛋白質分子量換算成對數值作縱坐標,作出標準曲線。測量蛋白抗原的電泳距離,在曲線上查出相應的分子量的對數值,即可計算出待測蛋白質的分子量。

  1.4  Western-blot

  1.4.1  材料

  1.4.1.1  材料 

  經上述SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳好的凝膠。

  1.4.1.2  試劑和儀器 

  甘氨酸(Gly,上海試劑三廠);小牛血清白蛋白(BSA,中科院生化所產品);辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG抗體(Sigma產品);半干式轉印電泳槽(上海醫科大學儀器中心產品);硝酸纖維膜(NC,浙江黃巖生化材料廠);印度墨水染色液(12.5mM Tris-HCI,pH 6.8,1%印度墨水);轉移電泳緩沖液(Tris 3g,Gly 14.4g,SDS 1g,ddH2O 600ml,臨用前加入甲醇150ml)。

  1.4.2  方法

  1.4.2.1  蛋白轉移電泳 

  將電泳好的凝膠去除濃縮膠和瓊脂糖,置于轉移電泳液中20min,裁取與凝膠相同大小的NC膜和6張濾紙,另置于轉移電泳液中15min,將3張濕濾紙、NC膜、凝膠、3張濕濾紙依次疊壓在一起,放入半干式轉印電泳槽中,再加入適量轉移電泳液,50V,電泳1h左右,將NC膜取出,用印度墨水染液染色,觀察轉移效果和標準蛋白位置。

  1.4.2.2  固相酶免疫檢測 

  抗原印跡NC膜放入PBS(含5% BSA、0.5% Tween-20)溶液中,室溫下平緩搖動5h;再切成3mm寬的條帶,置于反應槽中,加入按1∶10稀釋的待測血清及健康對照血清各1ml,室溫下平緩搖動2h,傾去反應液,用免疫印跡洗滌液洗滌三次,加入1∶400稀釋辣過氧化物酶標記羊抗人IgG(HRP-IgG)溶液1ml;室溫下平緩搖動1h,傾去反應液,用免疫印跡洗滌液洗滌三次,加入顯色底物液,至出現明顯的區帶,雙蒸水洗滌,2M H2SO4終止反應。

  2  結果

  2.1  臨床資料總結 

  根據臨床表現、組織病理及直接免疫熒光檢查共確診56例BP患者,其中男32例,女24例,男∶女=1∶33;年齡范圍36~94歲,平均年齡(66.64±14.09)歲,病程從0.5~1個月,平均病程(5.55±19.54)個月。其年齡分組情況見表1和圖1(略)。表1  56例BP患者的年齡構成(略)

    56患者中,黏膜損害的有17例,占30.36%。有癢感的25例,占44.64%,嚴重程度病情比較重的有32例,占57.14%;病情較輕的有24例,占42.86%;類型中大皰性的有48例,占85.71%;非大皰性的有8例,占14.29%。急性期的有39例,占69.64%;緩解期的有20例占35.71%。
從表1可看出,BP患者的發病年齡50歲以下的有12例,占21.43%,60歲以上的有40例,占71.4%。結果顯示BP多發于老年人。

  2.2  56例BP患者的免疫印跡結果 

  免疫印跡部分結果見圖2(略)(見附頁1)。從圖2看出,BP患者血清可結合230kD、180kD、230/180kD或230、180合并100kD等條帶。

  56例BP患者中,免疫印跡陽性的有50例(89.28%),陰性的有6例(10.71%);陽性者中,單獨抗原分子量180kD陽性的有16例(28.57%),單獨230kD陽性的有4例(7.14%),230kD、180kD同時陽性的有11例(19.64%),230kD和(或)180kD合并其他200kD、140kD、100kD的有18例(32.14%)。

  2.3  急性期、緩解期與免疫印跡結果的關系 

  免疫印跡與病期對應情況見表2和圖3(略)。表2  免疫印跡與病期對應情況表  病例數略)

    表2和圖3顯示:在BP的急性期抗體結合230kD、230kD/180kD、合并條帶抗原的占86.11%;疾病的緩解期抗體結合180kD抗原的占65%。

  3  討論

  類天皰瘡是一種好發于老年人的自身免疫性大皰病,臨床表現為紅斑基礎或正常皮膚上的緊張性大皰,尼氏征陰性,病情重者皮損累及全身,并可有黏膜損害,癢感輕重不等;病情輕的皮損可散在分布,也可表現為局限性分布。類天皰瘡可分為大皰性類天皰瘡、局限性類天皰瘡、疤痕性類天皰瘡、多形性類天皰瘡等,其病情反復遷延,可急性發作或臨床緩解。大多數類天皰瘡對激素敏感,用激素治療療效較好;少數對激素不敏感,須用免疫抑制劑、美滿霉素或雷公藤制劑等。

  56例類天皰瘡的臨床研究資料表明,類天皰瘡多發于60歲以上的老年人,就發病年齡不同于其他結締組織病,其原因尚待進一步探討。類天皰瘡的黏膜損害較天皰瘡少見,本研究中黏膜損害約占30%左右,而我科有關天皰瘡的資料表明天皰瘡的黏膜損害約占70%~80%左右;類天皰瘡以大皰性類天皰瘡最常見,其次為局限性、小皰性、癢疹性。

  BP患者如不進行治療。其病情可延續數月至數年。國外曾經有一項預測BP進程的研究,作者對該病的多項臨床及實驗室特征進行了分析,未能發現任何可預測疾病進程的指標[1]。最近有兩項對BP自身靶抗原與疾病預后相關性的研究,證實存在抗BPAG2循環抗體的患者病情較重,需要更大劑量的皮質類固醇激素控制病情,預后差[2,3]。說明BPAG2自身抗體在該病發病過程中起更重要的作用。

    免疫印跡技術常用于檢測類天皰瘡抗體,充分地提取表皮基底膜中的蛋白抗原成分,是運用免疫印跡技術測定該類抗體的重要組成部分。目前常用的分離表、真皮的方法有三種,即0.1mol/L EDTA分離法、56℃熱分離法和1mol/L NaCI分離法,我們實驗室采用56℃熱分離法分離表、真皮,結果表明本法對抗原活性影響較小且敏感性好,提取液中蛋白含量可達50mg/ml。
類天皰瘡是一種自身免疫性大皰病,其患者血清中有多種抗皮膚基底膜不同成分的抗體,有靶抗原分子量為230kD、200kD、180kD、140kD、100kD等,目前較公認的類天皰瘡抗體是抗原分子量為230kD和180kD,即BPAG1、BPAG2。我們的研究結果證實BP患者中有抗上述分子量蛋白的抗體。為了了解其與BP患者的臨床特征及易感基因的相關性,我們將上述抗體分為較常見的180kD、230kD、180kD和(或)230kD合并其他條帶四組進行總結。

  我們的研究結果顯示在BP的急性期抗體結合230kD、230/180kD、合并條帶抗原較常出現(86.11%);而在疾病的緩解期抗體結合180kD抗原較常出現(65%),這與國內外的有關報道是一致的[4]。
研究表明類天皰瘡抗體主要與基底膜區的兩個大分子多肽反應,即230kD、180kD分子。在較早期國外的免疫印跡結果顯示BP血清中有50%~70%能檢出230kD抗體,30%~50%血清中能檢出180kD抗體,故有的文獻中稱230kD抗原為BP的主要抗原,180kD抗原為BP的次要抗原[5],但近年來國內的研究結果發現180kD抗體的檢出率高于230kD,180kD抗原并不是BP的次要抗原。我們的免疫印跡結果顯示230kD抗體陽性為36例,占64.29%;180kD抗體陽性為41例,占73.21%,180kD抗體陽性率高于230kD抗體,且180kD抗體在疾病的急性期有陽性,在緩解期也持續陽性,提示這兩種抗體在疾病的不同時期其作用是有差異的。

  目前已知編碼BP抗原230kD的基因位于6號染色體短臂的6p11-12位點,編碼180kD的基因位于10號染色體長臂的10q24.3位點上,兩組基因表達的蛋白氨基酸順序和結構不同,230kD含2606個氨基酸,其空間結構可能是雙螺旋;180kD蛋白由1572個氨基酸組成,其結構有許多膠原域。超微結構定位表明BGAG1是一個細胞內蛋白,是構成半橋粒致密斑塊的主要成分;BPAG2是一個跨膜蛋白,其氨基端約55kD位于半橋粒致密斑塊上,羧基端約100kD在細胞外,中間是較短的跨膜域;這些BP抗原的編碼基因、氨基酸順序及結構、超微結構的差異決定了BPAG1、BPAG2這兩類靶抗原在疾病中的作用是不同的。

  近來研究的研究結果顯示,BPAG1和BPAG2在BP的發病過程中,其抗原性發生某種變化,導致器官特異的自身免疫,由于BPAG2的抗原決定簇在細胞外膠原域,首先激發免疫反應,自身抗體與BPAG2結合后激活補體,造成細胞膜破裂,此時細胞內的BPAG1的抗原決定簇也暴露,刺激免疫系統產生新的抗體,因此有人認為BPAG2在BP的發病過程中起更重要的作用,很可能是BP自身免疫發病中的始動因子;故在臨床上當患者BPAG1抗體增高時,疾病常處于進展期。

  【參考文獻】

  1  Collagen XVII/BP180:a collagenous transmwmbrane protein and component of the dermepidermal anchoring complex.Clin Exp Dermatol,2005 Nov,30(6):682-687.

  2  Demonstration of the molecular shape of BP180,a 180-Kda Bollous pemphigoid antigen and its potoential for trimer formation.J boil Chem,1996,271:13739-13745.

  3  Clinical manifestation in 100 Japanese billoss pemphigoid casea in relation to autoantigen profiles.Clin Exp Dermatol,1996,21:23-27.

  4  Anti-BP180 autoantibodies as a marker of poor prognosis in bullous pemphigoid.Br J dermatol,1997,136:694-698.

  5  Serum levels of autoantibodies to BP180 correlate with disease activity in patients with bollous pemphigoid.Arch Dermoto,2000,136:174-178.

  基金項目:上海市浦東新區科技局專項資金資助(項目編號:PKJ-2003-31)

  作者單位: 1 200120 上海,同濟大學附屬東方醫院皮膚科

        2 201203 上海,上海中醫藥大學肝病研究所

        
3 200030 上海,上海凱銳思公司

  (編輯:秋  實)


 


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