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葛根對成骨細胞OPG、RANKL mRNA 表達的影響

來源:中華醫學研究雜志 作者:吳乃中,李紅麗,崔淑云 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 目的 本研究用RT-PCR的方法觀察葛根中藥血清對成骨細胞細胞因子:OPG、RANKL mRNA表達的影響,力求從細胞水平和分子水平對葛根抗骨質疏松的機制進行探討,為葛根應用于臨床防治骨質疏松提供有力的實驗依據。出生24h內的SD大鼠,無菌取顱蓋骨,做成骨細胞培養。第三代成骨細胞 5×104/ml細胞懸液,24h待細胞貼壁......


  【摘要】  目的  本研究用RT-PCR的方法觀察葛根中藥血清對成骨細胞細胞因子:OPG、RANKL mRNA表達的影響,力求從細胞水平和分子水平對葛根抗骨質疏松的機制進行探討,為葛根應用于臨床防治骨質疏松提供有力的實驗依據。方法  將(250±10)g的SD大鼠36只,隨機分為兩組:對照組灌服生理鹽水,中藥組灌服2g/ml的葛根10ml/kg·d,1日2次灌胃,連續3天,最后一次灌胃后中藥組和對照組分別1h、2h、4h無菌操作股動脈采血,收集血清備用。出生24h內的SD大鼠,無菌取顱蓋骨,做成骨細胞培養。第三代成骨細胞 5×104/ml細胞懸液,24h待細胞貼壁后加入實驗因素,6天后用異硫氰酸胍一步法提取總RAN,然后用RT-PCR檢測OPG、RANKL mRNA的表達。結果  最后一次用藥后2h采血的中藥血清可明顯上調成骨細胞OPGmRNA表達,且明顯下調成骨細胞RANKL mRNA的表達。隨血清添加量的增加,對成骨細胞OPG mRNA表達上調作用越強,對成骨細胞RANKL mRNA的表達無影響。結論  實驗表明,葛根可能通過上調成骨細胞OPG mRNA的表達,下調成骨細胞RANKL mRNA的表達,抑制破骨細胞的產生和功能,為葛根防治骨質疏松提供了有力的實驗依據。

  【關鍵詞】  葛根;成骨細胞;OPG;RANKL

  The effect of roots of kudzu vine on the mRNA expression of OPG and RANKL of osteoblasts

  WU Nai-zhong,LI Hong-li,CUI Shu-yun.

  The Third Central Hospital of Baoding City,Hebei 071051,China

  【Abstract】  Objective  To explore the effects of roots of kudzu vine on the mRNA expression of OPG and RANKL of osteoblasts using RT-PCR. To provide the experimental base for its preventing and treating the OP in clinic, it is urgent to explore the mechanism of roots of kudzu vine anti-osteoporosis in cell and molecular level.Methods  36 SD rats weighting (250±10)g,are randomly divided into two groups. Control group and herb group were administered orally with physiological salt solution and with epimedium sagittatum maxim(2g/ml)twice a day at 10ml/kg body weight per day, respectively for three days. At the third day the serum was collected from the femoral artery at one hour, two hours and four hours after the last administration of medicine. Primary rat osteoblasts were isolated from newborn mouse calvariae. The third passage osteoblasts were plated at the density of 5×104/ml in 75ml culture flask, twenty four hours later treatment factors were added. Total RAN was extracted from osteoblasts using guanidine, and mRNA expression of OPG and RANKL were examined using RT-PCR.Results  Serum of roots of kudzu vine can up-regulate mRNA expression of OPG of osteoblasts and down-regulate mRNA expression of RANKL of osteoblasts.The effect of serum of medicine harvested at 2h after the last medicine administration is the most strong and the effect for OPG was in dose-dependent manner ,however the effect for RANKL was not in dose-dependent manner.Conclusion  The experiment showes roots of kudzu vine might inhibit the generate and function of osteoclast by up-regulating the mRNA expression of OPG and down-regulating mRNA expression of RANKL. It has provided the experiment base for roots of kudzu vine preventing and treating the OP in clinic.

  【Key words】  roots of kudzu vine;osteoblast;OPG;RANKL

  隨著老齡化社會的到來,骨質疏松癥已成為世界廣泛的問題之一。許多激素及細胞因子通過調節破骨細胞和成骨細胞這兩類細胞的數量和活性,使骨量維持動態平衡。成骨細胞骨形成功能的減退和/或破骨細胞骨吸收作用的增強可造成代謝性骨病,如骨質疏松。近年來發現的護骨素[1,2](osteoprotegerin,OPG)、核因子-κB受體活化子配體[3,4](receptor activator of NF-KappaB ligand ,RANKL)及其相關因子核因子-κB受體活化子[5](receptor activator of  NF-KappaB,RANK )對骨質疏松的發病機制和防治有了新的認識,并且成為骨代謝研究的新的靶點。OPG作為RANKL的誘騙受體阻斷其與表達于破骨細胞前體細胞和成熟的破骨細胞表面的功能性受體RANK的作用,從而抑制破骨細胞的分化和功能。OPG和 RANKL基因在成骨細胞均可表達,由成骨細胞分泌的OPG及RANKL在破骨細胞分化、成熟和信號傳遞過程中起著重要的調節作用。

  現代醫學證明葛根(roots of kudzu vine)主要的有效成分為異黃酮類,其有雌激素樣作用,屬于天然的植物雌激素(phytoestrogen,PE)。本研究用RT-PCR的方法觀察含葛根中藥血清對成骨細胞細胞因子:OPG、 RANKL mRNA表達的影響,力求從細胞水平和分子水平對葛根抗骨質疏松的機制進行探討,為葛根應用于臨床防治骨質疏松提供有力的實驗依據。

  1  材料與方法

  1.1  實驗動物  出生24h內的SD大鼠,(250±10)g SD大鼠,由河北醫科大學實驗動物中心提供。

  1.2  藥物與試劑  葛根(購于保定市第三中心醫院),DMEM培養基(GiBco),胰蛋白酶(GiBco),Ⅱ型膠原酶(Sigma),新生小牛血清(NCF)(北京鼎國生物試劑公司),RT-PCR試劑(北京賽百盛基因技術公司),PCR引物:OPG(gene bank:NM-012870) 北京賽百盛基因技術公司合成,上游引物:5’-CGAGTGATGAATGCGTGTA-3’ 下游引物:5’-TTCTGAAGTAGCAGGAGGC-3’ 擴增產物為301 bp; OPGL(gene bank: NM-057149)北京賽百盛基因技術公司合成,上游引物:5’-CCATCGGGTTCCCATAAAG-3’ 下游引物:5’-TGAAGCAAATGTTGGCGTA-3’ 擴增產物為 142bp;β-actin(gene bank: NM-031144)上海捷倍斯公司合成,上游引物:5’-GAGACCTTCAAGACCCCAGCC-3’ 下游引物:5’-TCGGGGCATCGGAACCGCTCA -3’ 擴增產物為404bp。

  1.3  主要器械與儀器  CO2培養箱(德國Heraus),倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠),PCR擴增儀(美國 MJ Research公司產品)。

  1.4  方法

  1.4.1  成骨細胞培養  出生24h內的SD大鼠,75%乙醇浸泡5min ,無菌取顱蓋骨,在D-Hanks液中認真刮去結締組織,清洗3次后將剪碎的骨片于0.25%胰蛋白酶室溫消化15min,0.1%Ⅱ膠原酶室溫消化45min,移入 DMEM(含20%小牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素)培養基,37℃ 5%CO2培養箱中培養,3天后換培養基,待細胞80%匯合后用0.25%胰蛋白酶消化,以含10%NCF的DMEM培養基吹打,制成細胞懸液,計數后傳代。

  1.4.2  動物分組及給藥  中藥葛根常規煎熬,加熱濃縮終濃度為2g/ml 。SD大鼠32只, 雌雄兼用,隨機分為2組: 中藥組,生理鹽水組(對照組), 20g/kg·d 1日2次灌胃,連續3天。

  1.4.3  含藥血清制備  最后一次灌胃后分別1h、2h、3h無菌操作股動脈采血,將大鼠血離心3000r/min 取血清,每組血清混勻,于56℃水浴30min滅活,-20℃保存,用時0.22μm微孔濾膜過濾,用無血清DMEM配成所需濃度。

  1.4.4  成骨細胞OPG及RANKL mRNA表達的檢測

  1.4.4.1  成骨細胞中總RNA的提取  成骨細胞傳至第三代,將細胞用0.25%胰蛋白消化,細胞計數后用含10%小牛血清的DMEM培養基制成5×104/ml細胞懸液,接種于75ml培養瓶,37℃ 5%CO2培養箱中培養,24h待細胞貼壁后加入不同時效和量效的中藥血清和對照組血清,每組重復4瓶,培養6天后采用異硫氰酸胍一步法提取總RAN,-70℃保存。

  1.4.4.2  RNA鑒定和定量  取5μl RNA溶液經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度和完整性,紫外燈下觀察;另取5μl RNA溶液稀釋后于260nm、280nm測定光密度,計算RNA含量及OD260nm/OD280nm 比值以確定其純度。選OD260nm/OD280nm比值在1.8~2.0間的RNA作RT-PCR。

  1.4.4.3  RT-PCR

  1.4.4.3.1  cDNA合成  取模板RNA 1.5μg和下游引物15pmol,混勻,70℃孵育5min,放入冰浴中,在反應體系中加入孵育的混合物和上游引物15pmol,補無菌三蒸水至20μl,混勻后短暫離心。放入PCR儀中,42℃60min,94℃5min。

  1.4.4.3.2  PCR  94℃變性40s,50℃退火40s,72℃延伸1min,循環30次,72℃延伸5min。

  1.4.4.3.3  PCR產物分析  PCR產物5μl上樣于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,電壓為3~5V/cm,電泳緩沖液為0.5×TBE,30min后停止電泳。紫外燈下觀察并用數碼相機照相,圖像用Adobe Photoshop軟件去色,轉換為TIF格式后用Tatallab v1.10軟件分析,得到待測的RNA擴增產物與內參照β-actin RNA擴增產物的光密度值,計算每一樣品和其內參照的比值:Asample/Aβ-actin以此作為目的基因RNA的相對表達量。

  1.4.5  數據處理  數據采用SAS軟件處理,均以x±s表示,兩樣本均數比較應用方差齊性檢驗、t檢驗和t’檢驗,組間比較用方差分析檢驗。

  2  結果

  2.1  不同時間中藥血清對成骨細胞OPG、RANKL mRNA表達情況的影響  見表1、表2。

  表1  不同時間中藥血清對成骨細胞OPG mRNA表達情況的影響(略)

  注:vs control★P<0.01

  表2  不同時間中藥血清對成骨細胞RANKL mRNA表達情況的影響(略)

  注:vs control★P<0.01
 
  Fig.1  (略)                

  Fig.2  (略)               

  Fig.3  (略) 

  由表1可知大鼠用藥后2h 采血的中藥血清組,OPG mRNA的相對表達量與對照組比較有明顯的統計學差異,P<0.01;1h和3h采血的中藥血清組OPG mRNA的相對表達量與對照組比較無統計學差異(P>0.05)。由表2可知2h 采血的中藥血清組RANKL mRNA的相對表達量與對照組RANKL mRNA的相對表達量比較顯著降低,P<0.01;1h和3h采血的中藥血清組RANKL mRNA的相對表達量與對照組比較無統計學差異(P>0.05)。說明最后一次用藥后2h采血的中藥血清可明顯上調成骨細胞OPGmRNA表達,且明顯下調成骨細胞RANKL mRNA的表達。電泳結果見Fig.1,2,3。

  2.2  不同濃度中藥血清對成骨細胞OPG 、RANKL mRNA表達情況的影響  見表3、表4。由表3可知在培養基中加入2h采血的不同濃度的葛根中藥血清, OPG mRNA的相對表達量與對照組OPG mRNA的相對表達量比較有明顯的統計學差異,P<0.01,并且10%與5%、20%與10%組間比較也有明顯的統計學差異,P< 0.01。說明隨血清添加量的增加,對成骨細胞OPG mRNA表達上調作用越強,具有劑量依賴性。5%、10%、20%的血清添加量時,RANKL mRNA的相對表達量與對照組比較有明顯的統計學差異,P<0.01,但10%與5%,20%與5%組間RANKL mRNA的相對表達量無統計學差異(P>0.05)。說明增加血清添加量對成骨細胞RANKL mRNA的表達無影響。電泳結果見Fig.4,5,6。

  Note:lane1 DNA Marker;lane2 control of 1h group;lane3 1h group;lane4 control of 2h group;lane5 2h group;lane6 control of 3h group;lane7 3h group

  表3  不同濃度中藥血清對成骨細胞OPG mRNA表達情況的影響(略)

  注:5% vs control,10% vs 5% and 20% vs 10%★P<0.01

  表4  不同濃度中藥血清對成骨細胞RANKL mRNA表達情況的影響(略)

  注:5% vs control★P<0.01,10% vs 5% and 20% vs 5%▲P>0.05
 
  Fig.4 (略)                 

  Fig.5 (略)             

  Fig.6 (略)

  Note:lane1  DNA Marker;lane2  control group;lane3  5% serum of medicine dosage group;lane4  10% serum of medicine dosage group;lane5  20% serum of medicine dosage group

  3  討論

  骨質疏松是常見的老年性疾病,多見于絕經后婦女,即絕經后骨質疏松,其以骨高轉化為特征。遺傳、雌激素、營養和生活方式與骨質疏松發病密切相關,主要還是因體內雌激素缺乏導致骨吸收大于骨形成,從而骨組織骨量進行性丟失,造成骨質有機物和無機物成比例地減少。但具體發病機制尚未闡明[6],多年來雌激素替代療法是目前防治本病的常用方法,而長期應用雌激素易出現乳腺痛、易怒、鈉水儲留,撤藥后子宮出血等副作用,甚至增加子宮內膜癌及乳腺癌的危險[7]。所以研究開發新的、安全有效的防治絕經后骨質疏松的藥物具有重要的臨床意義。

  骨重建過程主要由成骨細胞和破骨細胞共同參與,已經證實破骨細胞來源于骨髓中與單核巨噬細胞克隆形成單位(GM-CFU)不同的骨髓造血干細胞系,而成骨細胞來源于骨膜下發生于基質細胞的骨原細胞(osteogenic cell),這兩種細胞起源的的顯著差異和潛在的密切聯系一直為人們所關注。以往研究發現,影響破骨細胞分化及功能的多種鈣調激素和局部因子,如甲狀旁腺激素(parathyrion hormone,PTH)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、IL-11、1,25(OH)2D3等都不是直接作用于破骨細胞,而是首先作用于成骨細胞,再間接調控破骨細胞的形成和功能[8]。隨著OPG 、RANKL、RANK這些細胞因子的發現,對成骨細胞調控破骨細胞的形成及功能的分子機制有了深入的認識。OPG 、RANKL是成骨細胞正常的分泌分子,二者通過調節破骨細胞的生成、活化和凋亡而發揮調節骨代謝的作用。通過同源重組獲得的OPG無活性(OPG-/-)小鼠,證明OPG可阻斷破骨細胞形成和骨吸收。OPG(-/-)小鼠早期即引發骨質疏松癥,伴隨破骨細胞的增加,骨強度和骨密度下降,骨折發生率增加,成年OPG(-/-)小鼠表現出一系列的脊椎壓迫性骨折和股骨垢破壞[9]。Simonet等在過度表達OPG的轉基因鼠肝臟檢測此蛋白的生物活性,且血中出現高水平的OPG,此鼠表現出嚴重的股骨和脊椎的骨質硬化,并且破骨細胞數量的顯著減少,但并不伴隨巨噬細胞的減少。后來發現OPG能與RANKL結合,許多促吸收因子和激素作用于OPG以調節破骨細胞的生成和功能。RANKL具有多種生理作用,但對骨代謝的主要作用是刺激破骨細胞的分化,增強成熟破骨細胞的活性并且抑制其凋亡,從而導致骨吸收和骨丟失的增加。RANKL與破骨細胞及破骨細胞前體細胞上的功能性受體RANK結合, RANK 通過信號轉導作用于破骨細胞,促進破骨細胞的分化、融合、活化和生存并抑制其凋亡[10]。RANKL 是破骨細胞前體細胞分化的特異的,必需的因子。OPG有2個已知的TNF家族的配體,RANKL和TNF相關誘導凋亡配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)。OPG作為RANKL的誘騙受體競爭性抑制RANKL的作用,從而抑制破骨細胞的形成和功能,OPG為骨吸收的負性調節因子。由此可見骨質疏松的發病與OPG 、RANKL有著密切的聯系。葛根素為葛根有效成分之一異黃酮類的主要有效成分,有研究報道葛根素具有減少骨吸收,促骨形成,增加骨密度的作用[11],而在刺激子宮組織增生副作用方面又遠較雌激素為輕,但葛根對破骨細胞是否產生作用及作用的機制尚未闡明。

  通過本實驗表明葛根中藥血清,可提高成骨細胞OPGmRNA的相對表達量。大鼠最后一次用藥后2h采血的中藥血清作用最強,與對照組比較有統計學差異;5%、10%及20%的中藥血清添加量作用依次增強,說明有劑量依賴性。同時對成骨細胞RANKL mRNA的表達進行觀察,發現葛根中藥血清對其有抑制作用,且大鼠最后一次用藥后2h采血的血清作用最強,而5%、10%及20%的中藥血清添加量各組間作用無顯著性差異,說明無劑量依賴性。由此可見葛根可能通過上調OPG的表達和下調RANKL的表達減少破骨細胞的生成,抑制破骨細胞的活化,從而降低破骨細胞的骨吸收功能。有研究報道雌激素可與成骨細胞膜上的α-雌激素受體結合上調OPG的表達,盡管葛根的主要化學成分為黃酮類化合物,但至于葛根對OPG與RANKL的表達的調節是否以激素的方式發揮作用,及其具體調節的機制有待于進一步研究證實。

  以上實驗結果表明,葛根中藥血清可上調OPG的表達,下調RANKL的表達,這很可能是整體水平葛根抑制破骨細胞的生成和活化,從而發揮抗骨質疏松的分子基礎。我國是葛根藥用植物的分布中心,資源優勢明顯,因而在開發利用葛根來防治骨質疏松,尤其是絕經后骨質疏松大有作為。本實驗在細胞水平和分子水平,為葛根用于骨質疏松,尤其是絕經后骨質疏松的防治提供了有力的理論依據,具有重要的臨床價值。

  【參考文獻】

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  3  Yasuda H ,Shima N, Nakagawa N, et al. Identification of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin(OPG): a mechanism by which OPG inhibits osteoclastogenesis in vitro. Endocrinology,1998,139:  1329-1337.

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  7  Cauley JA, Lucas FL, Kuller LH, et al. Elevated serum estradiol and testosterone concentrations are associated with a high risk for breast cancer. Ann Intern Med,1999,130: 270-277.

  8  Jimi E,Nakamura I,Amano H,et al.Osteoclast function is activated by osteoblastic cells through a mechanism involving cell to cell contact.Endocrinology,1996,137(8):2183-2190.

  9  Mizuno A, Amiznka N, Irie K, et al. Severe  osteoporosis  in mice lacking osteoblastgenisis inhibitory factor/ osteoprotegerin. Biochem,Biophys Res Commn, 2000,247: 610-615.

  10  Fuller K,Wong B,Fox S,et al. TANCE is necessary and sufficient for osteoblast-mediated activation of bone resorption in osteoclast. Exp Med ,1998,188:997-1001.

  11  黃延玲,石鳳英.葛根素對去卵巢大鼠骨密度和骨代謝指標的影響.中國臨床康復,2004,8(12):2307-2309.

  (編輯:秋  實)

  作者單位: 071051 河北保定,保定市第三中心醫院


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