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組織因子途徑抑制物的生理功能及臨床應用價值

來源:中華醫學研究雜志 作者:梁旺,馬端 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 組織因子途徑抑制物(TFPI)是組織因子、Ⅶ因子和Ⅹ因子的天然抑制物,在維持正常凝血中發揮關鍵的生理作用。近年來,隨著對TFPI結構與功能研究的深化,發現它還能抗炎癥和誘導凋亡,并在動脈粥樣硬化、敗血癥和惡性腫瘤等疾病的治療上有重要的應用價值。本文將對TFPI的生理作用和臨床應用前景進行綜述。【關鍵......


    【摘要】  組織因子途徑抑制物(TFPI)是組織因子、Ⅶ因子和Ⅹ因子的天然抑制物,在維持正常凝血中發揮關鍵的生理作用。近年來,隨著對TFPI結構與功能研究的深化,發現它還能抗炎癥和誘導凋亡,并在動脈粥樣硬化、敗血癥和惡性腫瘤等疾病的治療上有重要的應用價值。本文將對TFPI的生理作用和臨床應用前景進行綜述。

  【關鍵詞】  組織因子途徑抑制物;結構;功能;生理作用;臨床應用
   
  Physiological functions and applications of tissue factor pathway inhibitor

  LIANG Wang,MA Duan.

  The Key Laboratory of Molecular Medicine,Ministry of Education,Shanghai Medical College,Fudan University, Shanghai  200032,China

  【Abstract】  Tissue factor pathway inhibitor (TFPI),the inherent inhibitor of tissue factor (TF) and factors Ⅶ and Ⅹ,is a key molecule that plays a regulatory role in the physiological coagulation.People’s knowledge on its structure and functions has been intensively enlarged in recent years.Besides the functions of anti-inflammation and introducing apoptosis,it was also found that TFPI could be served as medicine in treating some diseases such as atherosclerosis,sepsis and malignancy.This paper is a review mainly on the physiological functions and applications of TFPI.

  【Key words】  TFPI; structure; function; physiological effect; application

    組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)是外源性凝血途徑的天然抑制物。該因子早在20世紀初就被發現,但直到上世紀80年代,人們才對其展開深入系統的研究。1983年,Sander等首先闡明了TFPI抑制外源性凝血途徑的機制。1988年,Wun等首次克隆TFPI的cDNA,并據此推斷出它的氨基酸組成和空間構型,將其隸屬于Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制物家族。1990年后,人們先后對TFPI的基因定位、表達調控、分子生物學特性、基因工程表達、其他生理學功能,以及一系列疾病的治療作用進行了研究,獲得了許多重要進展。TFPI以其重要的生理學意義和對重大疾病的治療價值,吸引著人們對它的進一步關注。

  1  TFPI 基因和蛋白的結構特點

  1.1  TFPI的基因結構與定位 

  TFPI基因全長約86kb,定位于 2q31~2q32.1,由9個外顯子和8個內含子組成。其中外顯子1和2編碼 TFPI mRNA 的5′端非翻譯區,外顯子3編碼信號肽及N末端,外顯子4、6、8分別編碼TFPI的K1、K2和K3結構域,外顯子5和7編碼K1、K2和K3之間的兩段連接區,外顯子9編碼C末端和3′端非翻譯區。由于剪切形式的不同,TFPI 基因在轉錄后形成 4kb 和 1.6kb 2種mRNA,后者缺乏外顯子2(約2.6kb)。TFPI基因的上游調控區缺少TATA盒和GATA盒,它的轉錄主要受GATA元件的調控,轉錄因子GATA-2與TFPI表達呈明顯相關性[1]。

  1.2  TFPI的蛋白結構 

  TFPI 是一種全長由276個氨基酸殘基組成的耐熱單鏈糖蛋白,含K1、K2和K3三個Kunitz結構域,另外還包括2個連接區以及一個富含酸性氨基酸的N末端和一個富含堿性氨基酸的C末端。TFPI的空間結構比較復雜,所含18個半胱氨酸殘基構成9對二硫鍵,參與維持其二級結構,此外該蛋白還在117、167和228位的N原子上有糖基化修飾。結構域K1和K2是 TFPI 發揮抗凝活性的關鍵部位,K3在該作用中并非必需,但它的存在可以使 TFPI 更好地抑制凝血。近年來有不少研究表明,K3和C末端可以和肝素、膜表面糖蛋白及多糖結合[2],另外該區域還與 TFPI 的抗炎作用有關。糖基化修飾幾乎與 TFPI 生物活性無關。

  2  TFPI的生理功能

  生理條件下,TFPI主要由微血管內皮細胞合成,大部分錨著于內皮細胞,少量以游離形式存在,或者與脂蛋白、血小板結合后進入血流循環。TFPI的恒定表達對于內皮細胞的抗凝血功能及維持血液的正常流動非常重要。

  經典凝血理論將凝血途徑分為外源性凝血途徑和內源性凝血途徑,其中外源性凝血途徑是生理性止血的主要途徑。血管內皮細胞受損時,內皮下細胞表面的組織因子(tissue factor,TF)暴露于血液,外源性凝血途徑立即啟動。TF與血液中少量的FⅦ(FⅦa)結合,形成FⅦa/TF復合物,而后活化FⅩ和少量FⅨ,活化的FⅩ(FⅩa)激活凝血酶原變為凝血酶,從而引起凝血,少量FⅨa對FⅩ的激活則產生放大作用。但是,2004年 Genmin Lu 等人通過反應動力學實驗發現,生理條件下 Ⅶa/TF 活化的產物中,FⅨa 的活性明顯超過 FⅩa 的活性,進而提出外源性凝血途徑的早期是以 FⅨ 活化為主,而 FⅩa 則更傾向于是FⅨa 的活化產物[3]。

  TFPI 是外源性凝血途徑中主要的抑制因子,其抑制作用是分兩步實現的:首先,TFPI 通過K2與活化的 FⅩ 結合,并競爭性地抑制其活性,該過程是一個 Ca2+非依賴的可逆性過程;然后,FⅩa/TFPI 復合物中的 TFPI 通過 K1 與FⅦa/TF 復合物中的 FⅦa 活性部位結合,從而實現對 FⅦa/TF 復合物的抑制。FⅩa 輕鏈中谷氨酸殘基上的γ-羧基與Ca2+結合,并通過“鈣橋”結合于FⅩa/FⅦa/TF 復合物中 TF 附近的磷脂表面,使得 FⅩa/TFPI 與 Ⅶa/TF 形成穩固的 FⅩa/TFPI/Ⅶa/TF 四元復合物,該復合物可以被單核細胞和內皮細胞等吞噬清除。

  TFPI 和抗凝血酶-Ⅲ(anti-thrombin Ⅲ,ATⅢ)都能與 FⅩa 結合并抑制后者的活性。ATⅢ 對 FⅩa 的抑制是不可逆的。當外源性凝血途徑激活后,產生大量的 FⅩa,ATⅢ 快速與 FⅩa 結合并顯著地抑制其活性[3],所形成的復合物最后被清除。TFPI 與 FⅩa 的結合是一個可逆過程,兩者結合后一部分 FⅩa 的活性受到抑制。更重要的是,FⅩa/TFPI 復合物能在外源性凝血途徑活化的起始階段對 Ⅶa/TF 進行抑制,從而在根本上阻斷 FⅩ 和 FⅨ 的大量活化,避免了凝血因子及 ATⅢ 等抑制因子的大量消耗。由此可見,TFPI 在外源性凝血途徑的負反饋調節中起著非常重要的作用。

  3  TFPI 的抗炎功能

  感染性疾病患者常出現血液的高凝狀態。炎癥反應與凝血反應之間顯然存在著某些聯系。近年來發現,細菌及其釋放的內毒素一方面刺激某些炎癥細胞產生大量的前炎癥細胞因子,如 IFN-γ、IL-1β 和 TNF-α 等,它們均能刺激內皮細胞和單核細胞高度表達 TF;另一方面,細菌或內毒素也能直接刺激內皮細胞和單核細胞表達 TF。FⅩa 和凝血酶也能刺激激活的單核細胞和內皮細胞,合成并釋放 IL-6、IL-8 和其他炎癥反應因子,這些炎癥因子又通過自分泌或旁分泌的形式,促使 TF 在這些細胞中高表達[4,5]。可見炎癥與凝血是一種相互促進、相互惡化的關系。

  炎癥反應主要通過外源性凝血途徑引起血液高凝。TFPI 能從 FⅩa 和 TF水平阻斷炎癥反應與凝血反應之間的惡性循環,同時發揮抗凝抗炎的作用。動物實驗發現,靜脈注入外源性 TFPI,可以降低血漿中 IL-6 和 IL-8 等炎癥因子的水平,動物的存活率或存活時間都有所改善[6]。

  TFPI 也具有直接的抗炎癥作用。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)進入體內引起炎癥反應時需要有脂多糖結合蛋白(LPS binding protein,LBP)的存在。LBP 不僅介導 LPS 與 CD14 結合,導致炎癥反應,而且還能增加單核細胞及分葉細胞對 LPS 的敏感性。TFPI 可以干擾 LPS 與 LBP 的結合,或者通過其K3 及 C 末端與 LPS 直接結合,競爭性抑制 LPS 與 LBP 的結合[7],最終發揮抗炎作用。

  4  TFPI 與細胞凋亡和增殖

  Tsutomu Hamuro 首次發現 TFPI 可以誘導血管內皮細胞產生凋亡[8]。目前認為 TFPI 誘導凋亡的結構主要集中在 C 末端,與其抗凝作用無關。TFPI 誘導凋亡可能與極低密度脂蛋白(VLDL)受體有關,但僅有 TFPI 與 VLDL 受體結合并不足以啟動細胞凋亡,因此推測還有其他分子在起作用[9]。此外,有研究發現 TFPI 的 C 末端能抑制平滑肌細胞的增殖[10],其機制尚不清楚。TFPI誘導內皮細胞凋亡和抑制平滑肌細胞增殖對血管形成是一種負調節,有可能是其抑制腫瘤生長的機制之一。

  5  TFPI的應用價值

  5.1  TFPI與動脈粥樣硬化 

  TF 的暴露或高表達與許多血栓性疾病的發生發展密切相關。其中,對動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的研究較多。在AS患者增厚的內膜、斑塊部位的間質和細胞都能檢測到 TF 的高表達,而且越靠近斑塊脂質核心 TF 表達水平越高。作為對 TF 升高的一種代償性調節,TFPI 在 AS 中表達水平也是升高的,它和 TF 同時出現在斑塊區內皮細胞、壞死區周圍的巨噬細胞和平滑肌細胞中,但 TFPI 的數量遠遠達不到抑制 TF 的水平。一旦斑塊破裂,大量 TF 暴露并激活外源性凝血途徑,最終在局部形成血栓,是引起急性冠脈綜合征或腦梗死根本原因。臨床觀察發現 TF 與急性心肌梗死和不穩定性心絞痛有明顯的相關性[11],因此抑制 TF 活性對 AS 及急性冠脈綜合征的防治有著重要的意義。Badimon 等通過離體實驗發現,重組 TFPI 能顯著降低血小板及纖維蛋白在斑塊破裂部位的沉積[12],證實了 TFPI 在治療 AS 中的有效性,動物實驗也顯示出同樣的效果。

  除了容易形成血栓外,內膜增生也是 AS 發病過程中的一個重要方面。內膜過度增生所導致的遠端供血不足是不穩定性心絞痛發作的重要原因。Pierre 等人將 TFPI 基因局部轉染到經球囊損傷的 AS 血管,發現內膜增生受到明顯抑制[13]。因此,TFPI 的抗凝及抑制內膜增生的作用可能在 AS 和冠脈綜合征的治療中發揮作用。

  5.2  TFPI與深靜脈血栓 

  手術過程中對組織的損傷使大量的TF暴露于血液,容易形成高凝狀態或急性血栓。Dahm 等發現游離型和總TFPI的減少是深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis,DVT)的危險因素[14]。TF與TFPI之間的失衡,即TFPI對外源性凝血的調控不足是DVT發生的重要原因。重組人TFPI1-161(即缺乏K3和C末端的TFPI)在治療兔頸靜脈血栓時,有著與肝素同樣的效力,但出血等不良反應明顯減少[15]。因此,TFPI 有可能取代肝素應用于術后DVT的預防和治療。

  5.3  TFPI與感染性疾病 

  血液高凝狀態與炎癥反應是感染性疾病的兩大病理特征,常導致病情惡化甚至引發多功能臟器衰竭,從而直接威脅患者的生命,因此抗凝抗炎在嚴重感染性疾病的治療中越來越受到人們的重視。動物實驗發現,TFPI 能夠顯著改善嚴重感染動物的癥狀并提高其存活率[6,16]。

  國外對重組人TFPI(recombinant TFPI,rTFPI)治療敗血癥(sepsis)進行了一系列的臨床研究。Ⅰ期臨床試驗證實健康志愿者在接受 rTFPI 注射后表現出很好的耐受性,Ⅱ期臨床試驗中治療組 28 天死亡率相對安慰劑組降低約 20%,同時也顯示出一定的抗炎作用。盡管Ⅲ期臨床試驗的結果不如Ⅱ期理想,但仍發現 rTFPI 能顯著降低輕度敗血癥患者28天的死亡率(12% vs 22.9%)。目前對 rTFPI 治療敗血癥的Ⅲ期臨床試驗方案的設計存在爭議,因此 rTFPI 在敗血癥治療中的作用有待于進一步研究[17]。

  社區獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)是一種多發性感染性疾病,盡管使用了足量的抗生素,但病情嚴重的患者死亡率仍然很高。TF 在肺部的高表達與高凝狀態及炎癥反應密切相關,因此 TFPI 有望成為控制嚴重肺炎的藥物。目前,由 Chiron 公司推出的 rTFPI 治療嚴重社區獲得性肺炎的 Ⅲ期臨床試驗正在進行當中[18]。

  5.4  TFPI與惡性腫瘤 

  許多惡性腫瘤,如結腸癌、胃癌、肺癌乳腺癌、胰癌等,都伴有不同程度的凝血功能紊亂,該現象稱為特魯索綜合征(Trousseau syndrome),發生機制尚不清楚。研究發現許多腫瘤細胞表面都有 TF 的高表達,因此有學者推測可能是腫瘤細胞膜表面的 TF 脫落到血液中,引起患者出現高凝狀態。TF 不僅與惡性腫瘤的高凝有關,它還可以作為膜表面的受體分子與其配體 FⅦa 結合,引起細胞內信號轉導,從而導致腫瘤細胞的行為發生改變[19]。有研究表明 TF 可以促進腫瘤的侵襲轉移及血管生成,而這種效應與凝血作用無關。

  TFPI 同樣也可以抑制由 TF/FⅦa 引起的非凝血效應。Todd 給接種了黑色素瘤細胞的老鼠注入人 TFPI,發現腫瘤生長、血管生成受到明顯抑制[20]。此外,Amirkhosravi 用老鼠動物模型證實皮下注射鼠源 TFPI 可以顯著抑制黑色素瘤的侵襲轉移;將穩定轉染了 TFPI 基因的黑色素瘤細胞注入老鼠后,其侵襲性明顯下降[21]。隨著 TF 和 TFPI 在腫瘤發生發展中作用機制日見闡明,TFPI 有可能在將來的腫瘤治療中發揮一定的作用。

  5.5  TFPI 與其他疾病 

  有學者發現特異性肺間質纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)患者的支氣管肺泡灌洗液中存在大量的TF和TFPI,而且它們的水平與 IPF 病情呈正相關。免疫組織化學顯示TF和TFPI在增生的立方形柱狀上皮細胞上有高表達,但它們之間的不平衡促使局部形成高凝環境,從而導致纖維蛋白在肺間質的沉積[22]。成人呼吸窘迫綜合征(adult respiratory distress syndrome,ARDS)是另一種與纖維蛋白在肺部沉積相關的疾病,研究發現TF在該疾病中同樣有高表達,而TFPI水平正常或輕度升高,TFPI對TF的調控不足可能與ARDS的發展有關[23]。另外,還發現 TFPI 在腎病綜合征、1型糖尿病早期患者的血漿中有較高水平;胎盤早剝的子宮肌層、胎盤[24]也有較高水平的TF及TFPI表達;系統性紅斑狼瘡、白塞氏病血漿中游離型和總 TFPI 均降低。TF與TFPI水平的變化可能為這些疾病的診斷和治療提供一些有用的依據。

  6  展望

  在對 TFPI 生理學基礎及分子生物學特性有了深度認識的今天,人們逐步將研究的重點轉移到該分子與臨床疾病的關系上。許多疾病與 TFPI 表達降低或缺少有關,加入外源性 TFPI 可以不同程度地改善疾病狀況。其中,在血栓性疾病、感染性疾病治療和血管再狹窄的預防等方面已有大量的動物實驗甚至臨床試驗,因此 TFPI 也正在向臨床新藥的方向快速發展。盡管目前人們已經可以通過基因工程的方法獲得大量重組的人TFPI,但是過短的半衰期成為臨床應用的瓶頸。近期,我們實驗室研制的重組長效TFPI已獲成功[25],該突變體的半衰期為野生型的4倍,有望為 TFPI 的臨床應用提供更加廣闊的空間。

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  基金項目:國家自然科學基金(30271229)和上海市重點科技攻關(034319205)資助項目

  作者單位:200032 上海,復旦大學分子醫學教育部重點實驗室(△通訊作者)

  (編輯:宋冰)


 


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