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動態濁度法的建立及測定角膜真菌感染標本的初步研究

來源:中華醫學研究雜志 作者:劉宏偉,王香蘭,彭淑玲,周毅 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 建立動態濁度法,研究角膜真菌感染的檢測。方法 分別測定葡聚糖標準品、內毒素標準品、真菌標準株(煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌)及細菌標準株(綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌),測定19例臨床標本。結果 葡聚糖的濃度時間曲線為雙曲線,時間反應曲線顯示反應速率較低。內毒素的濃度時間曲線為直線,時間反應曲......


    【摘要】  目的  建立動態濁度法,研究角膜真菌感染的檢測。方法  分別測定葡聚糖標準品、內毒素標準品、真菌標準株(煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌)及細菌標準株(綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌),測定19例臨床標本。結果  葡聚糖的濃度時間曲線為雙曲線,時間反應曲線顯示反應速率較低。內毒素的濃度時間曲線為直線,時間反應曲線顯示反應速率較高。三種真菌的濃度時間曲線和時間反應曲線與葡聚糖的相似,革蘭陰性菌(綠膿桿菌)的濃度時間曲線和時間反應曲線與內毒素的相似,革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌)沒有反應。臨床19例標本,根據其濃度時間曲線和時間反應曲線的形態,11例確診為真菌感染,8例為革蘭陰性細菌曲線,為真菌和細菌的混合感染。結論  動態濁度法可用于角膜真菌感染的檢測,但對細菌-真菌混合感染不能確診。

  【關鍵詞】  動態濁度法;真菌;角膜;葡聚糖

  Establishment of the turbidimetric kinetic assay and measurement of fungus-infected corneal specimens

  LIU Hong-wei,WANG Xiang-lan,PENG Shu-ling,et al.

  Department of Pharmacology,Beijing Institute of Ophthalmology,Beijing Tongren Ophthalmology Center,Beijing Tongren Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100730,China

  【Abstract】  Objective  To establish the turbidimetric kinetic assay and study the measurement of fungus infection in corneal specimen.Methods  Glucan,endotoxin,fungus(Aspergillus fumigatus,Fusariun moniliforme  and  Fusariun solani) and bactiria(Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureaus) were measured.19 clinic specimens were also measured.Results  The concentration-time curve of glucan was hyperbola and its time-reaction curve had low reaction rate.The concentration-time curve of endotoxin was beeline  and its time-reaction curve had high reaction rate.The concentration-time curve and time-reaction curve of 3 fungi were same as that of glucan.The concentration-time curve and time-reaction curve of G- bacterium(Pseudomonas aeruginosa) were as same as that of endotoxin.The G+ bacterium(Staphylococcus aureaus) had no reaction.According the concentration-time curve and time-reaction curve,11 specimens were diagnosed fungi and 8 specimens were co-infection of fungi and bacteria.Conclusion  Fungi infection in cornea could be diagnosed by turbidimetric kinetic method.Co-infection of fungi and bacteria could not be diagnosed by this method.

  【Key words】  turbidimetric kinetic method;fungus;cornea;glucan

    角膜真菌感染的診斷較難,如不能及時治療,對患者造成損害,因此快速診斷非常必要。真菌的診斷一般采用鏡檢和培養的方法,鏡檢較快,但漏檢率較高,真菌培養的方法,檢出率較高,但時間較長。我們使用鱟試劑與真菌的葡聚糖反應的原理,建立動態濁度法并對角膜標本進行真菌測定。

  1  材料與方法

  1.1  試劑 

  葡聚糖標準品(031222,規格:300μg/ml),鱟試劑(批號040532,靈敏度:0.25Eu/ml)購自廈門鱟試劑廠,內毒素標準品(批號2002-7)和檢測用水(批號2003-3)購自中國藥品生物制品檢定所。

  1.2  儀器 

  BET-72細菌內毒素測定儀、振蕩器(天津大學無線電廠),超聲波處理器、離心機(Beckman公司)。

  1.3  葡聚糖和內毒素的濃度-時間曲線

  1.3.1  葡聚糖 

  將其倍比稀釋為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和 0.20μg/ml,取其200μl加入100μl鱟試劑,振蕩30s,放入BET-72細菌內毒素測定儀測定,測定溫度為(37±1)℃。

  1.3.2  內毒素 

  將其10倍稀釋為50、5、0.5、0.05和0.005EU/ml,按上述方法測定。

  1.4  細菌、真菌標準株的測定 

  細菌包括革蘭陰性菌(綠膿桿菌)和陽性菌(金黃色葡萄球菌),真菌包括煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌。在培養基上取少量菌落,加入1ml檢測用水,超聲波處理30min,2000cpm,10min,取上清。用檢測用水將其按10倍稀釋,分別取200μl加入100μl鱟試劑,振蕩30s,BET-72細菌內毒素測定儀測定。

  1.5  標本的處理 

  角膜標本來自北京普仁醫院眼科,為臨床確診真菌性角膜炎后,進行角膜移植,將角膜標本用檢測用水沖洗后,在潔凈臺中將其剪碎,加入1ml檢測用水超聲波處理30min,2000cpm,10min,取上清備用。

  1.6  標本的測定和結果的確定 

  共檢測臨床診斷真菌的感染的角膜標本19例,標本處理后,用檢測用水將其按10倍稀釋8個稀釋度,分別取200μl加入100μl鱟試劑,振蕩30s,放入BET-72細菌內毒素測定儀測定。根據標本的濃度-時間曲線、時間反應曲線和時間速率曲線確定。

  1.7  BET-72細菌內毒素測定儀的檢測指標 

  內毒素或葡聚糖與鱟試劑中的B、C或G因子反應,形成凝膠,記錄不同濃度的內毒素或葡聚糖在反應過程中不同時間的光密度值,確定OD值達到0.02的反應時間為測定反應時間,以反應時間為縱坐標,以藥物濃度為橫坐標,做圖,成為濃度時間曲線。時間反應曲線為某一濃度的內毒素或葡聚糖在不同時間的OD值,以時間為橫坐標,以樣品的OD值為縱坐標,做圖。時間速率曲線為某一濃度的內毒素或葡聚糖在不同時間的反應速率,以時間為橫坐標,以樣品的反應速率為縱坐標,做圖。

  2  結果

  2.1  葡聚糖的濃度時間曲線 

  葡聚糖的濃度時間曲線為雙曲線(圖1),低濃度時,反應時間較長,隨濃度的增加,反應時間減少,到達最低點后,反應時間隨濃度的增高而增加。時間反應曲線顯示,反應開始時,反應速率較低,曲線形態如“S”型。時間速率曲線顯示,不同濃度的葡聚糖的最大反應速率大部分在1000~2000s的時間范圍內。

   2.2  內毒素的濃度時間曲線 

  內毒素的濃度時間曲線為直線(圖2),反應時間隨內毒素濃度的增高而減少。時間反應曲線顯示,反應開始時,反應速率較高,曲線形態如同“倒L”型。時間速率曲線顯示,不同濃度內毒素的最大反應速率大部分在500~1000s時間范圍內。

  2.3  真菌標準株的結果 

  煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌的濃度時間曲線、時間反應曲線和時間速率曲線與葡聚糖的相似。

  2.4  細菌標準株的結果 

  綠膿桿菌的濃度-時間曲線、時間反應曲線和時間速率曲線與內毒素的相似。金葡萄球菌不能做出濃度時間曲線、時間反應曲線和時間速率曲線。

  2.5  臨床標本的檢測 

  檢測的19例臨床標本,根據濃度時間曲線、時間反應曲線和時間速率曲線,其中11例為真菌感染,有8例為細菌曲線,由于所有標本真菌培養陽性,為真菌和細菌混合感染。

  3  討論

  真菌性角膜炎是嚴重的致盲眼病,主要以鐮刀菌、曲霉菌、假絲酵母菌等感染為主[1,2],近年發病率不斷增多,發現戴軟鏡者[3]和激光手術后患者也有發病[4],此病由于難以確診(真菌培養需10天)延誤治療,以至引起失明,甚至喪失眼球。人們尋找快速診斷真菌感染的方法,鱟血提取液中的G-因子,可被真菌細胞壁特有成分(1~>3) beta-D-glucan(葡聚糖)激活后經過顯色或凝集反應進行檢測,可做真菌的定性和定量試驗,稱為G因子法。

  動態濁度法已在2005版藥典中用于對內毒素的測定[5],它是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間,我們用此方法分別測定內毒素標準品、葡聚糖標準品、真菌標準株及細菌標準株,并測定19例臨床標本。臨床標本是經培養確診為真菌感染,根據我們實驗的濃度時間曲線、時間反應曲線和時間速率曲線的形態,11例為真菌,8例為細菌的圖形,可能為真菌和細菌的混合感染。8例不能確診是由于鱟試劑中有G、B和C因子,B、C因子用于測定細菌,G因子用于測定真菌,細菌測定比真菌敏感,當兩者混合時,只能測定出細菌。多粘菌素已用于抑制內毒素的凝集反應[6],我們用多粘菌素來抑制BC因子的活性,由于多粘菌素純度不高,混有內毒素,結果不理想。革蘭陽性菌不影響檢測,革蘭陰性菌影響檢測。

  真菌的細胞壁較為堅固,我們對真菌標準品和臨床標本處理時,采用超聲的方法,以破壞真菌的結構。有學者從真菌中提取出葡聚糖[7]。

  G因子法已用于測定間質性漿細胞肺炎血中的葡聚糖[8],它可檢測小鼠念珠菌病[9]和檢測臨床病人深層真菌感染[10]。

  文獻報道,1ng~1μg葡聚糖與G因子可產生凝集反應[11],與我們的結果相似。 我們的實驗顯示產生反應的葡聚糖的濃度較高,為200ng~100μg,可能與鱟試劑的敏感性不同有關。真菌或含有真菌的標本以10倍稀釋,至少有3~4個濃度凝集反應顯著,而細菌在8個稀釋度中都有反應,另外真菌和革蘭陰性細菌的時間反應曲線和時間速率曲線不同,用此方法可檢測標本的真菌感染。我們將進一步分離G和B、C因子,進行特異性反應,可排除細菌對真菌檢測的影響。

  【參考文獻】

  1  Thomas.Current perspectives on ophthalmic mycoses.Clin Microbiol Rev,2003,16:730-797.

  2  王麗婭.我國真菌性角膜炎的研究現狀.眼科,2005,14:143-144.

  3  Salierno,Goldstein Driebe.Fungal ring infiltrates in disposable contact lens wearers.Clao J,2001,27:166-168.

  4  Karp,Tuli,Yoo,et al.Infectious keratitis after LASIK.Ophthalmology,2003,110:503-510.

  5  國家藥典委員會.中華人民共和國藥典,二部,附錄XI E,細菌內毒素檢查法,2005版,附錄87.

  6  Tsuchiya,Oishi,Takaoka,et al.Discrimination between endotoxin and (1~3)-beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate.Chem Pharm Bull (Tokyo),1990,38:2523-2526.

  7  Williams,McNamee,Jones,et al.A method for the solubilization of a (1~3)-beta-D-glucan isolated from Saccharomyces cerevisiae.Carbohydr Res,1991,219:203-213.

  8  Yasuoka,Tachikawa,Shimada,et al.(1~>3) beta-D-glucan as a quantitative serological marker for Pneumocystis carinii pneumonia.Clin Diagn Lab Immunol,1996,3:197-199.

  9  Nichterlein,Buchheidt,Hein,et al.Comparison of glucan detection and galactomannan enzyme immunoassay in gastrointestinal and systemic murine candidiasis.Diagn Microbiol Infect Dis,2003,46:103-108.

  10  Ostrosky-Zeichner,Alexander,Kett,et al.Multicenter clinical evaluation of the (1~>3) beta-D-glucan assay as an aid to diagnosis of fungal infections in humans.Clin Infect Dis,2005,41:654-659.

  11  Tsuchiya,Takaoka,Tokioka,et al.Development of an endotoxin-specific Limulus amebocyte lysate test blocking beta-glucan-mediated pathway by carboxymethylated curdlan and its application.Nippon Saikingaku Zasshi,1990,45:903-911.

  基金項目:北京市科技計劃項目課題(編號:9555101700)

  作者單位:100730 北京,首都醫科大學附屬北京同仁醫院,北京同仁眼科中心,北京市眼科研究所藥理室(△通訊作者)

  (編輯:秋實)


 


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