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家兔肝抑素對大鼠肝癌的作用

來源:中華醫學研究雜志 作者:陳博鄭穎 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 研究肝抑素(HC)對大鼠實驗性肝癌的治療作用和作用環節。方法 采用二乙基亞硝胺(DEN)誘導法建立大鼠肝癌模型。觀察大鼠肝臟的病理改變、肝表面癌結節數、肝重/體重。采用流式細胞儀檢測腫瘤細胞的動力學變化。...


  【摘要】  目的  研究肝抑素(HC)對大鼠實驗性肝癌的治療作用和作用環節。方法  采用二乙基亞硝胺(DEN)誘導法建立大鼠肝癌模型。觀察大鼠肝臟的病理改變、肝表面癌結節數、肝重/體重。以甲胎蛋白(AFP)、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)和堿性磷酸酶(ALP)作為觀察指標。采用流式細胞儀檢測腫瘤細胞的動力學變化。結果  大劑量HC的療效優于阿霉素(ADM),其作用環節是阻滯了G0~G1期細胞的增殖;中等劑量HC的療效與ADM相似,但其作用環節則是阻滯了G2~M期細胞的增殖。結論  本研究證實了HC在體內應用能抑制肝癌細胞的增殖,延緩肝癌的發生發展。

  【關鍵詞】  肝抑素;  大鼠;  肝腫瘤;  二乙基亞硝胺

  【Abstract】  Objective  To study the therapeutic effect and protective effect of experimental hepatocellular carcinoma in rats with rabbit hepatic chalone(HC).Methods  Hepatoma rats were induced by diethylnitrosamine(DEN).The changes of hepatoma nodules and ratio of liver/body weight were recorded and the alpha fetoprotein(AFP),γ-glutamyl transferase(γ-GT) and alkaline phosphatase(ALP) and the pathological changes of livers were observed.The cellular dynamic parameters were studied by flow cytometry.Results  HC of high dose group was better than adriamycin(ADM) group,the protective effect might be to postpone advancement of G0-G1 phase cells.HC of appropriate dose group was the same as ADM group,and the protective effect might be to postpone advancement of G2-M phase cells.Conclusion  The HC in this study could inhibit the prolifiration of hepatoma cells and delay the forming of hepatoma.

  【Key words】  hepatic chalone;rat;hepatocellular carcinoma;diethylnitrosamine

  肝抑素(hepatic chalone,HC)是由生物正常肝細胞通過自分泌和旁分泌作用產生的、能抑制肝細胞增殖的一種分子量為13500的多肽蛋白質,它在肝臟的再生調節機制中發揮著重要的作用。有研究[1]發現HC對人肝癌細胞(SMMC-7721細胞株)在體外的增殖有明顯的抑制作用,抑制率為77.7%,而對人胃癌細胞(BGC-823細胞株)的增殖則無抑制作用,提示HC是抑制肝癌細胞增殖的特異性因子。至于HC在體內應用是否可以抑制肝癌細胞的增殖,至今未見有文獻報道,因此很有必要對HC進行深入的探討和研究。本研究建立由二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)誘發的大鼠肝癌模型,采用病理學、血清生化指標和細胞動力學的方法,研究HC對大鼠體內肝癌的治療作用和作用環節。

  1  材料與方法

  1.1  動物分組  選取健康雄性SD大鼠(由廣東醫學院實驗動物中心提供)60只,體重100~120g,隨機分為6組(每組10只):正常組、模型組、阿霉素(adriamycin,ADM, 由浙江海正藥業股份有限公司生產)組和HC(本實驗室提純[2])治療組:A組,大劑量;B組,中等劑量;C組,小劑量。
  
  除正常組外,其余5組大鼠在飲水中均加入0.01%DEN(Sigma公司產品),喂養90天,停止喂養DEN,然后開始治療。

  1.2  治療方法  正常組和模型組每天1次腹腔注射生理鹽水0.5ml/只,而ADM組每天1次腹腔注射ADM 3mg/kg,A組每天1次腹腔注射HC 9mg/kg,B組每天1次腹腔注射HC 3mg/kg,C組每天1次腹腔注射HC 1mg/kg。給藥處理30天。
  
  ADM劑量的選擇以臨床化療劑量30mg/m2為依據,按人與大鼠間體表面積折算的等效劑量比值表計算得出。取折算得出的ADM劑量為HC的中等劑量(3mg/kg),并由此得出HC的大劑量(9mg/kg)和小劑量(1mg/kg)。

  1.3  常規檢查  稱體重,解剖大鼠,取出肝臟,稱肝重,計算肝重比體重,記錄肝表面癌結節數。

  1.4  生化檢測  斷頭取血,收集血清,用放射免疫測定法檢測血清甲胎蛋白(AFP)的分泌量,用7170A型自動生化分析儀(由日本島津公司制造)測γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)、堿性磷酸酶(ALP)的含量。

  1.5  病理檢查  統一取右葉肝組織,福爾馬林液固定,石蠟包埋,制備成2μm厚的切片,HE染色,光鏡下觀察肝組織的病理變化。

  1.6  流式細胞儀檢測  取3塊肝組織(每塊約為1g),制備離散肝細胞懸液,以碘化丙啶熒光素染色顯示核DNA,用流式細胞儀(美國BD公司產品,FACS Vantage)對樣品進行DNA含量分析,得出各細胞周期的分布比率。

  1.7  統計學方法  各組數據用x±s表示,組間比較采用t檢驗加方差分析。

  2  結果

  2.1  各組大鼠的生存率  實驗結束時,各組大鼠的死亡數和生存率見表1。

  表1  大鼠死亡數和生存率 (略)

  模型組5只大鼠的死亡原因均為腹腔內出血;ADM組3只大鼠的死亡原因也為腹腔內出血; A組2只大鼠的死亡原因同樣為腹腔內出血;B組1只大鼠死于惡病質,3只死于腹腔內出血;C組4只大鼠的死亡原因也是腹腔內出血。

  2.2  HC對大鼠肝癌病理改變的影響  尸檢發現,正常組肝臟外觀正常,無一例出現自發性肝癌,而模型組大鼠的肝臟明顯增大,各葉散在大小不等的灰白結節,少數成巨塊狀。光鏡下呈典型的柱狀及腺管樣癌巢結構,且癌巢周圍肝細胞異型性明顯,伴癌細胞浸潤。ADM組、A組、B組與C組大鼠也均有癌結節存在,但肝表面癌結節數明顯低于模型組(見表2),經統計學分析,ADM組、A組、B組與模型組的差異有顯著性(P<0.05)。而與ADM組相比,A、B、C三組中A組的差異有顯著性(P<0.05)。
  
  在4個治療組的病理切片中,A組有5例優于其余各組,切片顯示:細胞排列有序,細胞核大小一致,核漿比例基本正常,病理有絲分裂少見,癌巢周圍肝細胞異型性不明顯,無癌細胞浸潤。B組與ADM組相似,各有2例優于模型組,表現為:細胞排列紊亂,胞漿嗜堿性,核分裂相增多,可見多核和巨核細胞,但癌巢數明顯少于模型組,且癌巢周圍肝細胞異型性不明顯,有少量癌細胞浸潤。C組病理切片則與模型組接近。

  2.3  HC對大鼠體重、肝重、肝重比體重的影響  與正常組相比,模型組大鼠的體重均明顯低于正常組大鼠(P<0.05),肝臟重量和肝重比體重均明顯高于正常組(P<0.05)。與模型組相比,ADM組、A組、B組和C組大鼠的體重均明顯高于模型組(P<0.05),肝臟重量和肝重比體重明顯低于模型組(P<0.05)。與ADM組相比,A組和B組大鼠的體重高于ADM組,肝臟重量和肝重比體重低于ADM組,但經統計學分析只有A組的差異有顯著性(P<0.05)(見表2)。

  2.4  HC對大鼠血清中AFP、γ-GT、ALP的影響  與正常組相比,模型組大鼠的AFP、γ-GT、ALP水平均明顯高于正常組(P<0.05)。與模型組比較,ADM組、A組和B組大鼠的AFP、γ-GT、ALP水平均明顯低于ADM組(P<0.05)。與ADM組相比,A組大鼠的AFP、γ-GT、ALP水平均明顯低于ADM組(P<0.05)(見表3)。

  2.5  流式細胞儀檢測結果  與模型組相比,第120天時,A組G0-G1期細胞百分率顯著上升(P<0.05);ADM組、A組、B組和C組S期細胞百分率顯著下降(P<0.05);B組和C組G2-M期細胞百分率顯著上升(P<0.05)(見表4)。

  表2  ADM和HC對大鼠肝癌結節、體重、肝重、肝/體重比的影響  (略)

  注:※P<0.05,vs正常組;△P<0.05,vs模型組;□P<0.05,vs ADM組

  表3  ADM和HC對大鼠血清中AFP、γ-GT、ALP的影響  (略)

  注:※P<0.05,vs正常組;△P<0.05,vs模型組;□P<0.05,vs ADM組

  3  討論
  
  DEN為強烈的化學誘癌劑,其所誘發的大鼠肝癌為肝細胞癌,與人肝癌的發生過程相似。本實驗采用小劑量長期飲水法[3]誘發肝癌70天,再用ADM或HC腹腔注射,到實驗進行到120天時,處死大鼠。巨檢和組織切片顯微觀察發現,模型組大鼠肝癌發生率為100%,證明本次實驗中大鼠肝癌模型誘發成功。

  表4  ADM和HC對大鼠不同細胞周期的肝細胞比例的影響  (略)

  注:△P<0.05,vs模型組

  肝細胞癌變可能是由于在細胞分裂過程中致癌物引起細胞特異基因的改變,如肝細胞特異基因被封閉,以致與之相互聯系而又相互阻遏的分裂基因封閉,從而引起增生代謝與特異代謝關鍵酶活性不可逆的改變,使之失去正常肝細胞增殖與特異功能的平衡,而代之以不受控制的增生,最后形成癌細胞[4]。而目前肝癌的療效遠不理想的主要因素之一就是能做手術切除的早期肝癌不足1/5[5]。因此,從預防和治療的角度來看,抑制癌前細胞的增生或促進癌細胞的分化都有重要意義[4]。
  
  AFP是一種胚胎性蛋白,主要由胚肝產生,在肝癌中分泌量增高,因此,AFP被認為是診斷肝癌的標志蛋白。γ-GT在鼠肝中活性很低,而在誘癌過程中活性逐漸上升,故γ-GT被認為是肝癌變過程中早期癌前病變的生化標志。AFP和γ-GT已被作為維甲酸誘導人肝癌細胞分化的觀察指標[6]。Fanjul等[7]研究認為,ALP可作為肝癌細胞的分化標志。因此,本研究用AFP、γ-GT和ALP作為觀察肝癌細胞惡性表型逆轉的指標。結果表明,在誘癌過程中AFP、γ-GT和ALP有一致性的變化,三者均明顯升高,三者聯合能更好地觀察肝癌細胞的分化。
  
  在實驗中我們發現,模型組大鼠不僅全部發生肝癌,而且肝重/體重及AFP、γ-GT、ALP等指標均明顯高于正常組。但是,用不同劑量HC腹腔注射后,三種劑量HC治療組大鼠的體重明顯高于模型組,肝重/體重明顯低于模型組。其中大劑量和中等劑量的HC治療組大鼠的肝表面癌結節數和血清AFP、γ-GT、ALP等指標均明顯低于模型組。說明這兩種劑量的HC不僅能抑制腫瘤細胞的增長,還能促進腫瘤細胞分化。
  
  ADM自20世紀70年代開始臨床應用以來,是實體瘤治療最有效的藥物之一。在本研究中,各項指標均表明ADM對大鼠肝癌有著明顯的抑制作用,而和三種劑量的HC治療組相比,大劑量HC治療組大鼠的肝重、肝重/體重和血清AFP、γ-GT、ALP等指標均明顯低于ADM組,而中等劑量HC治療組大鼠的各項指標則與ADM組無明顯差別。提示大劑量HC的療效優于ADM,中等劑量HC的療效則與ADM相似。
  
  細胞周期和腫瘤的關系密切。不同周期時相的細胞對外界各種因素包括藥物和射線等敏感性不同,是化療和放療等抗癌的理論依據[8]。實驗結果表明,HC作用于肝癌細胞可引起細胞周期的改變,突出的特點是中小劑量HC治療組出現G2~M期阻滯現象,而大劑量HC治療組則出現G0~G1期停滯現象。其原因可能是:(1)HC在高濃度下顯著抑制細胞DNA合成,造成細胞從G1期向S期的發展受阻,G0~G1期細胞堆積或停滯;(2)惡性腫瘤細胞群體中,處于增殖周期的瘤細胞,即S期和G2~M期細胞,其分裂增殖能力很強,但同時對理化藥物的反應也最敏感,或被直接殺傷,表現為形態學死亡,或增殖活性受抑制[9]。我們推測,不同劑量的HC對肝癌細胞周期產生不同的影響,周期阻滯后的結果可能也各不相同。我們還發現,HC作用下S期細胞明顯減少。S期為DNA合成期,遺傳物質倍增主要發生在此期。中小劑量HC治療組S期細胞下降率雖不及大劑量HC治療組顯著,但與模型組相比其下降率也十分明顯,說明這兩組相對低劑量的HC同樣可顯著抑制肝癌細胞DNA的合成,只是作用強度不如大劑量的HC。
  
  本實驗以DEN誘發大鼠肝癌作為模型,以HC作為干預因素,發現大劑量和中等劑量HC對成癌過程有顯著的阻滯作用,而且HC使用起來具有針對性強、療效顯著、無明顯的毒副作用等優點,有減輕癥狀,延長生存期的作用,所以,HC是一種特異的抑制肝癌細胞增殖的生化藥物,有很好的臨床應用前景,值得進一步研究。

  【參考文獻】

  1  孫亞平,成令忠,劉銀坤,等.大鼠肝抑素純化及其對再生肝細胞和肝癌細胞增殖的影響.上海醫科大學學報,1997,24 (1):7.

  2  陳博,朱健平,唐浩,等.家兔肝抑素的提純和鑒定.中國藥業,2004,13(8):44.

  3  陳樹軍,張玉硯,許凱黎,等.二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌過程中血清甲胎蛋白分子變異體動態變化.腫瘤,1989,(1): 17.

  4  羅明,賀平,吳孟超,等.苦參堿和氧化苦參堿對二乙基亞硝胺誘發大鼠肝癌的預防阻斷作用.腫瘤預防雜志,2000,7 (6):561.

  5  吳孟超.肝膽外科的回顧現狀及展望.中國實用外科雜志,2000,20(1):5.

  6  艾兆偉,查錫良,劉毅,等.視黃酸對人肝癌細胞漿中某些表型的逆轉作用.生物化學與生物物理學報,1990,(2):135.

  7  Fanjul M,Theveniau M,Palecoby C,et al.Expression and characterization of alkaline phosphatase during diff erentiation of human pancreatic cancer (Capan-1) cells in culture.Biol Cell,1991,7(3):15.

  8  Seiter K,Feldman EJ,Tranganos F,et al.Phase 1 study on Taxol in acute leukemias: Evaluation of in vivo induction of apoptosis by Taxol. Leukemia,1995,9: 1961.

  9  Kerr JFR,Winterford CM,Harmon V. Apoptosis:Its significance in cancer and cancer therapy.Cancer,1994, 73:2013.

  作者單位:1 524023 廣東湛江,廣東醫學院生理科學實驗室

       2 524023 廣東湛江,廣東醫學院第一臨床學院2002級

  (編輯:守  中)


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