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VPA解除Met對大鼠皮質神經元GAD表達的抑制

來源:中華醫學研究雜志 作者:張旭向麗胡蟬麗 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 研究丙戊酸(VPA)、蛋氨酸(Methionine,Met)對大鼠皮質神經元谷氨酸脫羧酶(GAD)表達的影響,探討VPA對精神分裂癥的治療作用。方法 采用原代培養技術分組培養大鼠皮質神經元,收集細胞、制備GAD粗酶提取液,用比色法測定粗酶提取液GAD活力。分析空白組(無血清培養液)、Met組(無血清培養液含終濃度為2mM的......


  【摘要】  目的  研究丙戊酸(VPA)、蛋氨酸(Methionine,Met)對大鼠皮質神經元谷氨酸脫羧酶(GAD)表達的影響,探討VPA對精神分裂癥的治療作用。方法  采用原代培養技術分組培養大鼠皮質神經元,收集細胞、制備GAD粗酶提取液,用比色法測定粗酶提取液GAD活力;分析空白組(無血清培養液)、Met組(無血清培養液含終濃度為2mM的Met培養3天后換以無血清培養液)、VPA組(無血清培養液含終濃度為2mM的Met培養3天后換以終濃度為0.5mM的VPA 無血清培養液)的GAD活性。結果  Met組GAD平均酶活力明顯低于空白組,差異有統計學意義,而VPA組的GAD平均酶活力接近于空白組,差異無統計學意義。結論  蛋氨酸抑制大鼠皮質神經元表達GAD,降低GABA的合成;VPA促進皮質神經元表達GAD,可以使被Met抑制的GAD恢復到正常水平。

  【關鍵詞】  丙戊酸;蛋氨酸;谷氨酸脫羧酶;精神分裂癥

  【Abstract】  Objective  To study valproate and methionine(Met) regulate glutamic acid decarboxylase (GAD) expression in mouse primary cortical cultures nouron, investigate the mechanism of the VPA’s function in the treatment of schizophrenia.Methods  Adopting primary cortical cultures technique cultures neuron, collecte cells, lysis cells, use colorimetric method to measure GAD  activities; analyse  GAD activities of the vacancy group(serum-free DMEM),the Met group(cultures were incubated with Met at a final concentration of  2 mM in serum-free DMEM for 3days,after that change it with serum-free DMEM), and the VPA group(cultures were incubated with VPA at a final concentration of  2 mM in DMEM after that incubated with Met at a final concentration of  2 mM in serum-free DMEM for 3days).Results  In the Met group the average activities of GAD is obviously lower than the other two group, the difference has statistical meaning. In the VPA group the average activities of GAD is approach to vacancy group,the difference hasn’t statistical meaning.Conclusion  The methionine inhibits the cortical neuron express GAD, decreases GABA  synthesize. The VPA promotes the cortical neuron expression GAD, and renews GAD expression which had been inhibited by Met in mouse primary cortical cultures.

  【Key words】  valproate;methionine;glutamic acid decarboxylase(GAD);schizophrenia

  增加蛋氨酸(Methionine,Met)的攝入量,會造成近百分之七十的精神分裂癥(schizophrenia,SZ)患者癥狀惡化[1]。有學者認為的大量攝入Met引起大鼠體內活性甲基供給體S-腺苷同型半胱氨酸(SAM)增加,SAM使谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase.GAD)等基因啟動區甲基化修飾,引起GAD等基因表達降低[2]。在美國醫生普遍使用丙戊酸(valproic acid,VPA)輔助治療SZ。2001年Christopher[3]發現VPA能抑制組蛋白去乙酰基酶(Histone Deacetylase,HDACs)的活性,從而誘導基因表達。筆者通過原代培養技術培養大鼠皮質神經元,并在培養液中先后加入Met、VPA,然后用Berthelot[4] 反應測定不同組別的皮質神經元裂解液的GAD相對酶活性。如果Met 能抑制GAD基因表達,將使皮質神經元中GAD的相對酶活性降低,而如果VPA能誘導GAD基因表達,將使GAD恢復到正常水平。

  1  材料與方法

  1.1  試劑  多聚左旋賴氨酸,N2添加劑(100×的成分: 牛胰島素500μg/ml, 人轉鐵蛋白10000μg/ml, 黃體酮0.63μg/ml, 硒0.52μg/ml, 腐胺 1611μg/ml, Gibco),基礎培養液(DMEM、碳酸氫鈉、青霉素、鏈霉素),胎牛血清,兔抗GABA 血清(1∶600),羊抗兔IgG (1∶40),免疫組織化學試劑盒, Met、Gly 標準品,苯甲基磺酰氟(PMSF),非變性條件下裂解細胞的裂解液(pH 7.0的20mM Tris,150mM NaCl,1% Triton X-100,焦酸鈉,β-甘油磷酸,EDTA,Na3VO4,等),GABA (純度99.9 %),5′-磷酸吡哆醛(PLP), L-谷氨酸鈉 (L-MSG),次氯酸鈉, Folin-酚試劑,牛血清白蛋白,巰基乙醇,重蒸酚,無水乙醇等。

  1.2  動物  孕期16~18天清潔級SD大鼠, 由鄭州大學動物中心提供。

  1.3  方法

  1.3.1  大鼠皮質神經元分組培養  大鼠皮質神經元的體外培養參照陳麗敏[5] 完全培養液組的培養方法。以5×105/孔的數量接種大鼠皮質神經元于多聚左旋賴氨酸處理過的24孔培養板。以新配制的完全培養液(基礎培養液+N2添加劑+10%胎牛血清)培養細胞,3天后換以無血清培養液(基礎培養液+N2添加劑)分組繼續培養。實驗分三組,每組8個孔:空白組,無血清培養液;Met組,無血清培養液含終濃度為2mM的MET,培養3天后換以無血清培養液;VPA組,無血清培養液含終濃度為2mM的Met,培養3天后換以終濃度為0.5mM的VPA的無血清培養液。將細胞放置于溫度37℃、體積分數為5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱中培養。分組培養6天后將細胞用于各類實驗。

  1.3.2  GABA能神經元的免疫細胞化學(PAP法)鑒定  培養細胞用4%多聚甲醛固定, 0.2% Triton X-100和0.03% H2O2/甲醇溶液于室溫下處理30min, 羊血清蛋白(1∶50)37℃ 1h,經兔抗GABA血清(1∶600)4℃孵育72h,再經羊抗兔IgG(1∶40)37℃ 1h,兔抗PAP復合物(1∶40)37℃ 1h, 用DAB 4HCl/H2O2(0.05%/0.01%)呈色35min,貼片、脫水、透明及封片。上述每步驟間均用PBS充分洗滌, 光鏡下觀察。

  1.3.3  谷氨酸脫羧酶活性的測定  (1)粗酶提取液的制備:去除培養液,用PBS、生理鹽水(含最終濃度為1mM的PMSF)洗一遍細胞。每孔加入100μl非變性條件下裂解細胞的裂解液。用槍吹打數下,使裂解液和細胞充分接觸。裂解液接觸細胞2s后,細胞就會被裂解。于4000r/min 下離心5min,得到的上清液即為粗酶液。裂解細胞的所有步驟都在冰上進行。采用Lowry 法測定蛋白質濃度后,用磷酸鹽緩沖液稀釋到3g蛋白/L。冰箱短時間保存備用。(2)采用比色法測定粗酶提取液谷氨酸脫羧酶的活性:取0.2ml 50mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.8),其中含5mmol/L L-MSG及0.2mmol/L 的PLP,加入0.1ml 待測粗酶提取液和0.1ml 蒸餾水(對照組加入0.1ml 2mM的Met,實驗組加入0.1ml 2mM的Gly),于37℃水浴中保溫30min;迅速置于冰浴中止反應,加入0.2ml 0.2mmol/L pH 9.0 的硼酸緩沖液,1ml 6%的重蒸酚溶液, 0.4ml次氯酸鈉溶液,充分振蕩;沸水浴10min 后,冰浴20min不斷振蕩,直至有藍綠色化合物出現,然后加入2ml 60%的乙醇于645nm 下比色。以已知濃度的GABA 作對照。在上述測定條件下,以每分鐘生成1μmol 的GABA 所需的酶量為一個酶活單位(U)。每組測定同時做3次重復, 求平均值。

  1.3.4  統計學方法  全部數據以(x±s)表示,采用SPSS10.0 統計軟件,平均數比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有顯著性。

  2  結果

  2.1  培養細胞的觀察  于種植完全培養液3天后, 于倒置顯微鏡下觀察可見大部分細胞貼壁,神經元約占據培養板面積的2/3 左右, 胞體以呈橢圓形和三角形者占多數, 部分細胞胞體為多角形, 多數神經元長出2個以上的突起,并與鄰近神經元的胞體或突起形成接觸,90% 以上膠質細胞死亡浮起,表明大鼠皮質神經元的體外培養成功;分組繼續培養6天后各組神經元胞體繼續增大, 突起長度及數量繼續增加, 基本鋪滿培養板, 膠質細胞極少,表明在加入Met和VPA分組后大鼠皮質神經元生長正常。隨機取20個視野(200×,0.44mm2/視野),計數每個視野中胞體折光性好、長出突起、生長狀態良好的細胞,比較各組的存活細胞數。結果列于表1,表明不同組別細胞存活數沒有差別(P>0.05),說明Met在2mM的濃度范圍內、VPA在0.5mM的濃度范圍內均不影響神經元的生長。

  表1  不同組別細胞存活數、GABA陽性細胞數及谷氨酸脫羧酶相對酶活性的比較  (略)

  注:aF=0.13,P>0.05;bF=1.41,P>0.05;cF=57.807,P<0.05,n=8

  2.2  GABA能神經元細胞數的比較  用免疫細胞化學反應顯示不同組別的細胞均主要是GABA能神經元(84%左右)。實驗組免疫反應陽性的神經元所占比例與其他兩組相比差異無顯著性(數據見表1)。說明在下一步實驗中裂解細胞獲得的粗酶提取液三組均主要來源于GABA能神經元。

  2.3  谷氨酸脫羧酶活性的測定  酶活性測定結果列于表1,可以看出空白組和VPA組酶活性沒有差別, Met組的酶活性明顯低于上兩組。說明蛋氨酸抑制大鼠皮質神經元表達GAD,降低GABA的合成;VPA促進皮質神經元表達GAD,可以使被Met抑制的GAD恢復到正常水平。

  3  討論

  培養細胞的觀察表明不同組別細胞存活數沒有差別,說明Met在2mM的濃度范圍內、VPA在0.5mM的濃度范圍內不影響神經元的生長。免疫細胞化學反應顯示不同組別的細胞均主要是GABA能神經元,說明裂解細胞獲得的粗酶提取液三組均主要來源于GABA能神經元,酶活性測定結果說明蛋氨酸抑制大鼠皮質神經元表達GAD,降低GABA的合成,VPA促進皮質神經元表達GAD,可以使被Met抑制的GAD恢復到正常水平。GABA系統的異常是精神分裂癥的病理生理特點之一,神經遞質GABA具有能使多巴(DA)向下調節的作用,還可以作用于中腦前葉及皮質DA能神經通路[6]。GABA是由GAD催化L-MSG裂解而生成的。GAD的表達受多種因素調節,其中啟動子的CpG島的胞嘧啶5′碳原子的甲基化修飾和組蛋白乙酰化修飾是其中的兩種主要調控方式。

  Met在體內可增加SAM的供給,而SAM的增加可以促進基因的甲基化修飾而引起GAD等基因表達降低。這可能是Met使SZ患者癥狀惡化的原因。Tremolizzo[2]在大鼠腹腔注射Met (6.6 mmol/kg 15天,1天2次)引起大鼠體內活性甲基供給體SAM增加,并且發現大鼠腦中GAD mRNAs顯著減少,筆者通過原代培養技術培養大鼠皮質神經元,然后用Berthelot[4] 反應測定不同組別的皮質神經元裂解液的相對酶活性。所得結果與Tremolizzo的結果相同,既Met 能抑制GAD基因表達,將使皮質神經元中GAD的相對酶活性降低。
2001年Christopher[3]發現VPA能抑制組蛋白去乙酰基酶(Histone Deacetylase,HDACs)的活性,組蛋白末端的乙酰化與轉錄激活相關,而去乙酰化與轉錄抑制相關。Francesca在大鼠腹膜內注射VPA(200ng/(kg·d),30天),然后用鼠基因組U34 Affymetrix寡聚核苷酸芯片(包含8799已知的探針)分析大鼠腦中基因的表達,發現有87種基因表達下調、34種基因表達上調[7],被影響的基因產物參與多種調節通路和代謝途徑。我們的研究表明VPA促進皮質神經元表達GAD,并且可以使被Met抑制的GAD恢復到正常水平。這也可能是聯合使用VPA類藥物治療SZ能快速改善患者的癥狀的主要原因。

  【參考文獻】

  1  Brune G G,Himwich H E. Effects of methionine loading on the behavior of schizophrenia patients. J Nerv Ment Dis,1962,134:447-450.

  2  L Tremolizzo G, Carboni W B, Ruzicka C P,et al.An epigenetic mouse model for molecular and behavioral neuropathologies related to schizophrenia vulnerability.PNAS,2002, 99 (26):17095-17100.

  3  Christopher J, Phiel F Z, Eric Y,et al. Histone deacetylase is a direct target of valproic Acid, a potent anticonvulsant, mood stabilizer, and teratogen.J Biol Chem, 2001,276(39): 36734-36741.

  4  許建軍,江波,許時嬰,等.比色法快速測定乳酸菌谷氨酸脫羧酶活力及其應用.微生物學通報,2004,31(2):66-71.

  5  陳麗敏, 陳曉春, 林挺巖,等.大鼠皮質神經元的體外培養和純化.福建醫科大學學報,2002,36 (3 ):239-241.

  6  李華芳,林治光,顧牛范.γ-氨基丁酸與精神分裂癥的治療.上海精神醫學,2000,12(增刊):25-26.

  7  Francesco Impagnatiello, Alessandro R. Guidotti, Christine Pesold,et al.A decrease of reelin expression as a putative vulnerability factor in schizophrenia.PNAS,1998,95(26):15718-15723.

  8  Francesca B,Jane M, Bella P M. Microarray analysis of rat brain gene expression after chronic administration of sodium valproate.Brain Research Bulletin,2005, 65:331-338.

  作者單位:1 450052 河南鄭州,鄭州大學基礎醫學院生物化學教研室

       2 450003 河南鄭州,河南省人民醫院神經內科

  (編輯:悅  銘)

 


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