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腦缺血再灌注誘導大鼠信號轉導與轉錄激活子-1的變化

來源:中華醫學研究雜志 作者:李洪春馬萍徐凱Δ楊春Δ 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 探索局灶腦缺血/再灌注不同時間誘導大鼠缺血中心區(同側皮層)和周圍區(同側紋狀體)信號轉導與轉錄激活子-1(STAT1)的激活變化。方法 采用SD雄性大鼠線栓法制作右大腦中動脈缺血(MCAO)局灶腦缺血模型。運用抗STAT1和抗磷酸化STAT1抗體做免疫印跡(IB)檢測缺血2h再灌注不同時間缺血中心區和周圍區ST......


  【摘要】  目的  探索局灶腦缺血/再灌注不同時間誘導大鼠缺血中心區(同側皮層)和周圍區(同側紋狀體)信號轉導與轉錄激活子-1(STAT1)的激活變化。方法  采用SD雄性大鼠線栓法制作右大腦中動脈缺血(MCAO)局灶腦缺血模型。運用抗STAT1和抗磷酸化STAT1抗體做免疫印跡(IB)檢測缺血2h再灌注不同時間缺血中心區和周圍區STAT1的表達及激活變化。結果  缺血2h再灌注不同時間,缺血中心區及周圍區STAT1的磷酸化水平顯著增加,再灌注24h達到峰值,與假手術組相比分別增加約3.1和3.8倍(P<0.05),但在整個再灌注過程中其蛋白表達并沒有明顯的變化。結論  局灶腦缺血再灌注能引起缺血中心區和周圍區STAT1磷酸化水平的顯著增加,提示缺血性腦損傷誘導STAT1的激活可能參與缺血同側皮層及紋狀體神經元細胞的病理生理過程。

  【關鍵詞】  MCAO;局灶腦缺血;信號轉導與轉錄激活子-1(STAT1)

  【Abstract】  Objective  To investigate the activation of signal transducer and activator of transcription-1(STAT1) after focal brain ischemia in the lesion core (cerebral cortex) and lesion periphery(striatum). Methods  Middle cerebral artery occlusion (MCAO) ischemia model of SD rats was used in this study. The content of STAT1 protein and changes of p-STAT1 in the cerebral cortex and striatum homogenates were assessed by immunoblotting(IB) using anti-STAT1 and anti-p-STAT1 (Tyr 701) antibodies.Results  The expression of STAT1 protein was not significantly altered during ischemia 2h and reperfusion different time, but phosphorylation levels of STAT1 was continuously increased and peaked at 24h of reperfusion in the cortex and striatum (3.1-and 3.8-folds vs sham respectively). Conclusion  The activation of STAT1 was induced in the lesion core and lesion periphery following focal cerebral ischemia. The increments of p-STAT1 could involve in the changes of pathophysiology in the nervous cells.

  【Key words】  focal cerebral ischemia; signal transducer and activator of transcription-1 (STAT1); middle cerebral artery occlusion (MCAO)

  STAT1作為信號轉導與轉錄激活子(Signal Transducers and Activators of Transcription,STATs)家族的成員之一,在IFN-γ介導的生物學效應中起到必不可少的作用,并介導多種細胞因子、生長因子、激素等從細胞表面受體并轉入核內的胞內信號,它是一種具有信號轉導與轉錄激活雙重功能的蛋白質,存在于多種類型的組織和細胞中,它的激活與免疫反應和細胞生長抑制有關[1]。以往的研究表明多種應激因素包括熱、活性氧、缺血等都能激活STAT1[2~4]。本實驗運用MCAO(middle cerebral artery occlusion)局灶腦缺血模型,研究缺血中心區皮層和周圍區紋狀體,在缺血2h再灌注不同時間引起的STAT1的快速激活,旨在探索STAT1在缺血性腦損傷中的病理反應機制。

  1  材料與方法

  1.1  試劑  抗STAT1抗體(M-22,sc-592)為Santa Cruz Biotechlogy產品,抗p-STAT1單克隆抗體(Tyr701,#9171)購自Cell Signalling公司。Na3VO4和Leupeptin等所有蛋白抑制劑為Sigma產品。硝酸纖維素薄膜(NC膜)為Pharmacia產品。HEPES為Amresco產品。其余試劑為國產分析純。

  1.2  動物及腦缺血模型  雄性Sprague Draley (SD) 大鼠18只(徐州醫學院實驗動物中心提供),體重250~320g,隨機分為三小組。采用Longa等[5]線栓改良法建立SD大鼠單側大腦中動脈缺血(MCAO)模型,即10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉,鈍性分離右頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)。結扎CCA、ECA,微動脈夾夾閉ICA,在CCA近動脈分叉處剪破一小口,插入栓線,栓線進深距CCA分叉處約18~20mm,松開微動脈夾,在ICA根部結扎,栓線的末端留在皮膚外,再灌注時從頸內動脈抽出栓線即可,栓塞性缺血2h分別再灌注0、0.5、1、2、4、6、24h。假手術組栓線進深為5mm,不插入頸內動脈。

  缺血后神經系統表現按照Longa的5分制評分標準進行評分,0分:無神經缺損癥狀;1分:對側前肢不能完全伸展;2分:向對側旋轉;3分:向對側傾倒;4分:不能自發走,意識喪失。1~4分為動物缺血模型成功的標志。

  1.3  樣本制備和測定  于缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)不同時間點,立即斷頭取腦,根據MRI表現取材(文章另發表),迅速分離出缺血側大腦中動脈區中心區皮層和周圍區紋狀體,液氮凍存備用。

  以下操作均在冰水中進行,從液氮中取出標本加0.7ml勻漿緩沖液[含HEPES 20mmol/L,(pH 7.9), NaCl 400mmol/L, EDTA 1mmol/L, DTT 1mmol/L, Na3VO4 1mmol/L, PNPP 1mmol/L, PMSF 0.5mmol/L及蛋白抑制劑 Leupeptin、 Pepstatin 、 Aprotinin各10mg/L]。用Teflon勻漿機高速勻漿,加10%的NP-40 40μl,冰浴30min,15000g×30min離心,小心移取上清液,測蛋白后分裝,置-80℃冰箱待用。

  1.4  蛋白質含量測定  參照以前的方法[6],以牛血清白蛋白為標準蛋白。

  1.5  蛋白質免疫印跡檢測(IB)  參照以前的方法[6],即等量蛋白樣品(100μg)經10%SDS-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后,以濕轉法電轉移至NC膜上,轉移后的NC膜經3% BSA封閉后加入不同的稀釋好的一抗(抗STAT1多抗1:100,抗p-STAT1抗體1:1000),4℃過夜,洗膜后加入相應的二抗(羊抗鼠Ig-AP,1:1000),37℃反應2h;以NBT/BCIP顯色,結果以圖像處理儀(Gene Company)處理。

  1.6  統計學方法  數據以均數±標準差(x±s)表示,統計分析采用單因素方差分析(ANOVA),多實驗組與一個對照組比較采用最小顯著差法(LSD),多個實驗組之間比較采用q檢驗(Newman-keuls test),P<0.05為統計學差異有顯著性。

  2  結果

  2.1  缺血2h再灌注不同時間缺血中心區皮層STAT1的表達及激活變化  采用免疫印跡法分析假手術(Sham)、I 2h/R 0、I 2 h/R 0.5 h、I 2h/R 1h、I 2h/R 2h、I 2h/R 4h,I 2h/R 6h,I 2h/R 24h缺血中心區皮層勻漿核抽提液STAT1的蛋白表達及磷酸化水平(圖1)。結果顯示缺血2h再灌注不同時間并不能影響皮層STAT1蛋白表達水平,而STAT1的磷酸化水平則持續增加,再灌注24h達峰值,約為假手術組的3.1倍。

  圖1  缺血2h再灌注不同時間同側皮層 (略)

  2.2  缺血2h再灌注不同時間缺血周圍區紋狀體STAT1的表達及激活變化  以抗STAT1和p-STAT1抗體作免疫印跡檢測缺血周圍區紋狀體勻漿核抽提液中STAT1的表達及磷酸化水平,結果顯示缺血2h再灌注0、0.5、1、2、4、6、24h,缺血周圍區紋狀體組織中STAT1蛋白表達水平并沒有明顯的變化,而磷酸化水平則持續顯著增加,再灌注24h時達高峰,其增加量約為假手術組的3.8倍(圖2)。

  圖2  缺血2h再灌注不同時間同側紋狀體STAT1的表達及激活變化 (略)

  3  討論

  STAT-1在腦組織中廣泛分布,在腦缺血過程中細胞凋亡是重要的細胞死亡機制,缺血性腦損傷引起大量細胞因子及生長因子的釋放,如IL-6、TNF-α等。以往的研究表明,腦缺血的刺激激活了JAKs-STATs信號通路。本研究我們采用SD大鼠線栓法右大腦中動脈缺血(MCAO)局灶腦缺血模型,運用免疫印跡法分析表明,缺血2h再灌注不同時間,缺血中心區皮層STAT1的蛋白表達水平雖無明顯變化,但其磷酸化水平卻持續顯著增加,再灌注24h時達高峰,一方面可能與腦缺血時細胞的ATP被耗竭,即所謂的細胞能量衰竭[7],再灌注后ATP水平顯著升高有關。另一方面,在急性腦缺血再灌注后反應性活性氧(reactive oxygen species, ROS)的過多產生,常常超過抗氧化酶的能力造成氧化應激和細胞破壞,ROS是缺血性神經元凋亡的多效介導者,可以導致鉀通道調節的血管擴張,改變血管的反應性、局灶性的內皮損傷和血腦屏障的破壞,促進細胞的凋亡,且在血管平滑肌細胞中氧化應激能夠激活STAT1[8],可見缺血再灌注后STAT-1的持續激活可能與再灌注損傷有著密切聯系[9]。此外,缺血導致的STAT1激活與缺血性腦損傷導致大量細胞因子和生長因子的釋放,尤其是IFN-γ在MCAO的缺血組織中大量合成有關[10]。我們的研究同時顯示在缺血周圍區紋狀體內STAT-1同樣被持續激活,這與West等[11]報道一致,提示在該區即使沒有出現細胞立即死亡,可能也有些細胞進入了程序性死亡的過程中,如果給予及時治療有潛在的被拯救的可能性。

  最近報道,綠茶的一種主要成分綠茶多酚物——表沒食子兒茶素沒食子酸酯(polyphenolic agent Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是STAT-1磷酸化活化的有效抑制劑。用EGCG和綠茶提取物(green tea extract,GTE)來培養心肌細胞和離體鼠心臟,發現兩者可顯著減少STAT-1的磷酸化而保護心肌細胞免受I/R誘導的細胞凋亡[12]。那么,在局灶腦缺血的中心區或周圍區,這兩種物質是否也可以抑制STAT1的酪氨酸或絲氨酸的磷酸化水平而減少腦損傷?這些我們都將繼續研究下去。

  【參考文獻】

  1  Dell’Albani P, Santangelo R, Torrisi L, et al. Role of the JAK/STAT signal transduction pathway in the regulation of gene expression in CNS. Neurochem Res, 2003, 28(1):53-64.

  2  Liu T, Castro S, Brasier AR, et al. Reactive oxygen species mediate virus-induced STAT activation: role of tyrosine phosphatases. J Biol Chem, 2004, 279(4):2461-2469.

  3  Takagi Y, Harada J, Chiarugi A, et al. STAT1 is activated in neurons after ischemia and contributes to ischemic brain injury. J Cereb Blood Flow Metab, 2002, 22(11): 1311-1318.

  4  Planas AM, Justicia C, Ferrer I. Stat1 in developing and adult rat brain. Induction after transient focal ischemia. Neuroreport, 1997, 8(6): 1359-1362.

  5  Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989,20(1): 84-91.

  6  Li H, Zhang Q, Zhang G. Signal transducer and activator of transcription-3 activation is mediated by N-methyl-D-aspartate receptor and L-type voltage-gated Ca2+ channel during cerebral ischemia in rat hippocampus. Neurosci Lett, 2003, 345 (1): 61-64.

  7  White BC, Sullivan JM, DeGracia DJ, et al. Brain ischemia and reperfusion: molecular mechanisms of neuronal injury. J Neurol Sci, 2000, 179(S 1-2): 1-33.

  8  Madamanchi NR, Li S, Patterson C, et al. Thrombin regulates vascular smooth muscle cell growth and heat shock proteins via the JAK-STAT pathway. J Biol Chem, 2001, 276(22):18915-18924.

  9  Chan PH. Reactive oxygen radicals in signaling and damage in the ischemic brain. J Cereb Blood Flow Metab, 2001, 21(1): 2-14.

  10  Li XL, Hassel BA. Involvement of proteasomes in gene induction by interferon and double-stranded RNA. Cytokine, 2001, 14(5): 247-252.

  11  West DA, Valentim LM, Lythgoe MF, et al. MR image-guided investigation of regional signal transducers and activators of transcription-1 activation in a rat model of focal cerebral ischemia. Neuroscience, 2004, 127(2): 333-339.

  12  Townsend PA, Scarabelli TM, Pasini E, et al. Epigallocatechin-3-gallate inhibits STAT-1 activation and protects cardiac myocytes from ischemia/reperfusion-induced apoptosis. FASEB J, 2004, 18(13): 1621-1623.

  基金項目:徐州醫學院附屬醫院資助項目(No.2006034)

  作者單位:221002 江蘇徐州,徐州醫學院附屬醫院檢驗科(Δ影像科)
 
  (編輯:秋  實)


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