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RP-HPLC測定腫瘤Ⅰ號膠囊中蘆薈大黃素、大黃素與大黃酚的含量

來源:中華醫學研究雜志 作者:金藝趙榮淑張月輝劉興超趙懷清 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 目的 建立腫瘤Ⅰ號膠囊中蘆薈大黃素、大黃素與大黃酚的含量測定方法。0ml/min,柱溫35℃,檢測波長為254nm。結果 蘆薈大黃素在1。1μg/ml濃度范圍內,大黃素在1。...


  【摘要】  目的  建立腫瘤Ⅰ號膠囊中蘆薈大黃素、大黃素與大黃酚的含量測定方法。方法  采用高效液相色譜法,色譜柱為 Kromasil ODS-1(4.6 mm×200 mm, 5μm),以甲醇-0.1%磷酸(75 : 25)為流動相,流速為1.0ml/min,柱溫35℃,檢測波長為254nm。結果  蘆薈大黃素在1.38~22.1μg/ml濃度范圍內,大黃素在1.31~21.0μg/ml濃度范圍內,大黃酚在 2.20~35.2μg/ml的范圍內與峰面積呈良好的線性關系,相關系數均為0.9999。方法平均回收率分別為98.1%(RSD=1.2%),98.6%(RSD=0.99%)和97.4%(RSD=1.4 %)。結論  方法簡便,準確,重現性好,可作為腫瘤Ⅰ號膠囊質量控制方法之一。

    【關鍵詞】  腫瘤Ⅰ號膠囊;蘆薈大黃素;大黃素;大黃酚;hplc

  Simultaneous determination of Aloe-emodin,Emodin and Chrysophanol in ZhongliuⅠcapsule by HPLC

  JIN Yi, ZHANG Yue-hui, LIU Xing-chao,et al.Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016, China

  【Abstract】  Objective  To develop a HPLC method for simultaneous determination of Aloe-emodin、Emodin and Chrysophanol in ZhongliuⅠcapsule.Methods  The analysis was used with a Kromasil ODS-1(4.6mm×200mm,5μm) column and a mobile phase of methanol -0.1% phosphoric acid solution(75:25).The flow rate was 1.0ml/min and column temperature was 35 ℃. The detection wavelength was set at 254nm.Results  The calibration curve was linear within the range of 1.38~22.1μg/ml for Aloe-emodin,1.31~21.0μg/ml for emodin and 2.20~35.2μg/ml (r=0.9999) for Chrysophanol, the average recoveries were 98.1%(RSD=1.2%)for Aloe-emodin, 98.6%(RSD=0.99%)for Emodin and 97.4%(RSD=1.4%) for Chrysophanol.Conclusion  This method was convenient, accurate and reproducible for determination of Aloe-emodin, Emodin and Chrysophanol  in ZhongliuⅠcapsule.

  【Key words】  ZhongliuⅠcapsule; aloe-emodin; emodin; chrysophenol;HPLC

    腫瘤Ⅰ號膠囊由莪術、丹參、大黃、淫羊藿等十余味藥材提取加工制成,臨床上治療乳腺各類癌瘤、乳腺增生、乳腺炎均獲得滿意效果。有研究表明,大黃抗癌作用的主要成分為游離蒽醌衍生物和糖類。蒽醌類衍生物可通過抑制腫瘤細胞的呼吸和物質代謝,抑制DNA、RNA的生物合成達到抗癌作用[1]。本研究以大黃中蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚為檢測指標成分,建立了腫瘤Ⅰ號膠囊中蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚的同時含量測定方法,結果表明該方法簡便快速,分離度好,結果準確可靠。

  1  儀器與試藥

  日本島津LC-10AT型高效液相色譜儀,SPD-10A型紫外檢測器;KQ-50B型超聲儀。蘆薈大黃素對照品、大黃素對照品和大黃酚對照品購于中國藥品生物制品檢定所,甲醇為色譜純,其他試劑為分析純,水為重蒸水。

  2  方法與結果

  2.1  色譜條件  色譜柱:Kromasil ODS-1(4.6mm×200mm,5μm),流動相甲醇︰0.1%磷酸(75∶25;v/v),柱溫35℃,流速1.0ml/min,檢測波長254nm,進樣量20μl。在上述色譜條件下進樣分析,理論塔板數按蘆薈大黃素峰計算不低于2500,按大黃素峰計算不低于3000,按大黃酚計算不低于4000。蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚峰與相鄰色譜峰的分離度均>1.5。陰性對照對樣品測定無干擾,色譜圖見圖1。

  圖1  HPLC色譜圖 略

  2.2  線性關系試驗  分別取蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚對照品適量,精密稱定,置50ml量瓶中,分別用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成濃度分別為0.092μg/ml、0.088μg/ml和0.088μg/ml的對照品儲備液Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ。依次精密量取對照品儲備液Ⅰ,Ⅱ 0.15, 0.3, 0.6, 1.2和2.4ml;Ⅲ0.25,0.5,1.0,2.0和4.0分別置于10ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成系列濃度的混合對照品溶液。分別取上述溶液各20μl按上述色譜條件進樣分析。以對照品濃度X(μg/ml)為橫坐標,峰面積Y為縱坐標,繪制標準曲線并進行回歸計算,回歸方程分別為
蘆薈大黃素: Y=0.079×104X+6.584×102(r=0.9999,n=5)大黃素:Y=4.788×104X+5.661×103(r=0.9999,n=5)大黃酚:Y=6.748×104X+5.258×102(r=0.9999,n=5)結果表明,蘆薈大黃素在1.38~22.1μg/ml濃度范圍內,大黃素在1.32~21.2μg/ml濃度范圍內,大黃酚在2.20~35.2μg/ml的范圍內,Y與X之間具有良好的線性關系。

  2.3  對照品溶液制備  精密量取上述對照品儲備液Ⅰ0.6ml,Ⅱ0.6ml,Ⅲ1.0ml置10ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得(每1ml含蘆薈大黃素5.52μg,含大黃素5.25μg,含大黃酚8.80μg)。

  2.4  供試品溶液制備  取樣品粉末0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入甲醇25ml,回流提取30min,放冷,濾過,回收溶劑,殘渣加15ml 8%鹽酸溶液溶解,再加20ml氯仿加熱回流1h,放冷,置分液漏斗中,分取氯仿層,酸液繼續用氯仿提取3次,每次20ml,合并氯仿層,回收溶劑,殘渣加甲醇溶解并轉移至5ml量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,微孔濾膜(0.45μm)過濾后取續濾液作為供試品溶液。

  2.5  陰性對照溶液制備  按處方比例稱取除大黃以外的其余藥味,按2.4項下“供試品溶液制備”操作,制成陰性對照溶液。吸取20μl進樣,觀察樣品峰的保留時間處是否有雜質峰干擾。結果表明:樣品峰保留時間處無雜質峰干擾。

  2.6  色譜系統精密度試驗  取同一對照品溶液,在相同的色譜條件下連續進樣6次,計算蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚色譜峰面積的RSD分別為0.69%、0.82%和1.1%(n=6)。

  2.7  方法重復性試驗  取同一批號樣品粉末5份,按“供試品溶液制備”項下方法操作,平行制備5份樣品,在上述色譜條件下進行分析測定,蘆薈大黃素含量的相對標準偏差RSD為1.1% (n=5);大黃素含量的相對標準偏差RSD為2.0% (n=5) ,大黃酚含量的相對標準偏差RSD為1.4%(n=5)。

  2.8  穩定性試驗  取同一份供試品溶液,室溫下靜置,分別于0,2,4,8,12,24h按上述色譜條件測定,測得蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為1.1%、2.6%和1.1%,結果表明供試品溶液在24h內穩定。

  2.9  回收率試驗  采用加樣回收法,稱取已知含量的供試品9份,按低、中、高濃度分別精密加入蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚對照品儲備液,每一濃度3份,按上述色譜條件測定。分析結果見表1。

  表1  回收率試驗結果  (略)

  2.10  樣品測定  取3批樣品,每批取3份,按2.5項下的方法制得供試品溶液,按上述色譜條件測定,記錄色譜峰面積,計算蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚的含量。結果見表2。

  表2  含量測定結果  (略)

  3  討論

  3.1  色譜條件的選擇  為同時測定蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚的含量,參考相關文獻[2,3],試用甲醇-0.5%冰醋酸,乙腈-0.1 %磷酸,甲醇-0.1 %磷酸等流動系統,經過試驗,以甲醇-0.1%磷酸為流動相,蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚與其他組分均能達到基線分離。

  3.2  檢測波長的選擇  分別測定蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚的紫外光譜,結果表明,三種成分均在254nm附近有最大吸收,故選擇254nm作為測定波長。

  3.3  提取方法的選擇  大黃含有游離型和結合型蒽醌成分,含量測定是檢測游離型蒽醌成分總含量,故采用水解同時提取的方法。經考察,甲醇回流提取時間在0.5、1.0、1.5h范圍內結果無明顯差異,故提取時間為0.5h。選擇乙醚、氯仿作為提取溶劑進行考察,結果表明氯仿優于乙醚,且操作相對簡單。

  本復方制劑藥味多,測定含量時干擾較大。采用本法測定,具有簡便,重復性好,且穩定的特點,可作為腫瘤Ⅰ號膠囊質量控制方法之一。

  【參考文獻】

  1  姜曉峰,甄永蘇.大黃逆轉腫瘤細胞多藥抗藥性作用.藥學學報,1999,34(3):164-164.

  2  劉東平.HPLC法測定大敗毒膠囊中大黃素和大黃酚的含量.現代中藥研究與實踐,2005,19(3):35-37.

  3  盧文彪,曾元兒.大承氣湯顆粒劑質量控制研究.湖南中醫藥導報,2002,8(4):148-151.

  作者單位: 1 110016 遼寧沈陽, 沈陽藥科大學藥學院

       2 110015 遼寧沈陽,沈陽市藥品快速檢驗

  (編輯:悅  銘)


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