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同種移植激活的宿主樹突狀細胞能介導免疫耐受*

來源:中華醫學研究雜志 作者:許奇齊,李 玫,王松霞,薛殷彤 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 目的 依據T細胞的發育機制理論,誘導針對移植物特抗原的異性免疫耐受。方法 先用致死劑量的γ射線,將受者的T細胞及干細胞去除,形成了一個不具干細胞、前T細胞和T細胞的受者模型,稱受者模型Ⅰ。同時經同種皮膚移植制造正常的受者對供者器官的免疫排斥反應的模型,稱模型Ⅱ。從模型Ⅱ中經免疫磁珠分選取得被供......


  【摘要】  目的  依據T細胞的發育機制理論,誘導針對移植物特抗原的異性免疫耐受。方法  先用致死劑量的γ射線,將受者的T細胞及干細胞去除,形成了一個不具干細胞、前T細胞和T細胞的受者模型,稱受者模型Ⅰ。同時經同種皮膚移植制造正常的受者對供者器官的免疫排斥反應的模型,稱模型Ⅱ。從模型Ⅱ中經免疫磁珠分選取得被供者抗原所激活的、具有抗原提呈功能的樹突狀細胞,與正常的事先準備好的受者骨髓細胞在體外混合后回輸至受者模型Ⅰ中。受者Ⅰ完成免疫造血功能重建后,再對其行同種皮膚移植。分5組,分別觀察移植皮片的存活時間,并常規病理組織切片和流式細胞分析檢測。結果  由T細胞發育的上游誘導產生特異性的免疫移植耐受,比較對照組,實驗組皮片存活時間顯著延長(P<0.005),流式細胞分析和病理組織學分析差異也有顯著性。結論  在所建立的模型和系統中,能誘導移植物特異性的免疫耐受,也進一步驗證了胸腺的陰性選擇理論。

    【關鍵詞】  樹突狀細胞; 移植; 耐受; 胸腺; T細胞發育

      Induction of transplantation tolerance with allograft-activated host dendritic cells

    XU Qi-qi,LI Mei,WANG Song-xia,et al.Department of Immunology,Peking University Health Science Center,Beijing 100083,China

    【Abstract】  Objective  The negative thymic selection is critical for the maturation of bone marrow derived cells to T cells.Negative selection occurs in thymic medulla and is normally mediated by bone marrow derived APC,like dendritic cells (DC) or macrophages.Immunodominant allopeptide-pulsed host dendritic cells can successfully induce transplantation tolerance.Methods  Host dendritic cells were activated by allo-skin transplantation on day -10 to present the donor-specific antigens.Murine recipients of allogeneic skin grafts on day 0 were given transfusion of these activated dendritic cells and isogeneic bone marrow cells after lethal irradiation.Results  Transfusion of donor-antigen-specific activated host dendritic cells plus isogeneic bone marrow cells led to prolonged skin allograft survival in recipients treated with lethal irradiation.In contrast,bone marrow cells transfusion alone failed to induce donor-specific tolerance.Conclusion  In the absence of chronic immunosuppression,transfusion of donor antigens activated dendritic cells can prolong skin allograft survival markedly.

    【Key words】  T cell development;dendritic cells;transplantation;tolerance;thymus

    器官移植在人造組織、器官成功應用之前仍然是挽救某些不可逆病變的最優的治療手段。而造成移植手段失敗的主要原因是由于移植后的排斥反應造成[1]。發展更為精細的組織配型以及大量新的免疫抑制藥物的開發與應用是目前國內外對付排斥反應的手段。但是,移植供體的局限性必將導致HLA配型的局限性;而免疫抑制劑的毒性和副作用又限制了其長期和大量的應用[2,3]。因此,如何克服免疫排斥反應目前仍然是國內外外科學家和醫生急于探討和急需解決的課題。誘導移植受體對供體器官產生特異性免疫耐受可以避免長期應用免疫抑制藥物所引起的非特異性免疫抑制及其他毒副作用,被認為是防止器官移植排斥的理想方法[4~6]。

  T細胞,是介導細胞和體液免疫反應的核心細胞,也是排斥反應中的核心細胞。如果能使T細胞對于移植供體產生免疫耐受,將成為解決排斥反應的有效方法。但是,由于外周TCR庫的豐富內涵,以及供體組織器官的抗原多樣性,使得誘發外周T細胞對于移植產生耐受的方案具有相當的難度,至今在國內外的解決辦法也就是應用一些T細胞的抑制劑。為此,我們設計新的技術路線,要尋求出一種方法,既能誘導出T細胞對供體組織器官的耐受,而又能保持T細胞的正常免疫功能,以期待得到解決此問題的理想方案。眾所周知,外周不同的T細胞和TCR都是源于相同的骨髓來源的前T細胞,其多樣性是在胸腺發育過程中通過TCR基因重排而產生的,而其自身免疫耐受主要是產生于T細胞在胸腺發育過程中的陰性選擇,通過陰性選擇,克隆清除自身反應性T淋巴細胞,這是中樞耐受的主要機制之一[7,8];最新的研究還發現,非刪除性的耐受在中樞耐受中也有著極其重要的作用,主要包括CD4+、CD8+調節性T細胞Treg的作用[5,6];S.F.Oluwole等[9,10]發現通過胸腺內給與提呈供者MHC多肽的激活的DCs能誘導移植物特異性免疫耐受,同時,通過外周靜脈途徑,也能誘導類似的耐受,進一步研究表明其耐受形成機制可能是由于體內同種MHC激活的同種反應性T細胞回流入胸腺所致,這些抗原特異性激活的反應性T細胞能從血流進入胸腺,對于維持獲得性的免疫耐受至關重要。如果能夠從T細胞發育的上游部位,造成T細胞發育的選擇,即選擇對移植物的耐受,將可能成為克服排斥,成就無毒無害之免疫耐受的有效方案。

    1  材料與方法

    1.1  動物  雌性BALB/c(H2d,受者)、雄性C57BL/6(H2b,供者)和雄性129(H2k,特異性對照供者)鼠,由北京大學醫學部動物中心提供,均為6~8周齡,全部的動物都飼養于北京大學醫學部實驗動物部SPF-II級動物房。

    1.2  試劑硫酸新霉素和小鼠淋巴細胞分層液HISTOPAQUE○R-1083購自Sigma-Aldrich,Inc公司。Dynabeads○R小鼠pan T (Thy 1.2)磁珠標記的抗體購自Dynal,Inc.公司。PE標記抗小鼠CD4抗體,FITC標記抗小鼠CD8抗體由北京大學醫學部免疫學系提供。DMEM和PBS由北京大學人民醫院提供。

    1.3  激活并分選宿主樹突狀細胞  為激活宿主樹突狀細胞(DCs),在分選細胞前的第10天,給BALB/c宿主動物行同種異體皮膚移植,皮片供者為C57BL/6鼠。然后于收獲細胞的當天處死這些BALB/c宿主動物,取它們的脾臟,通過HISTOPAQUE○R-1083小鼠淋巴細胞分層液離心分層收獲單核細胞,再使用Dynabeads○R小鼠pan T (Thy 1.2)磁珠抗體通過陰性分選去除小鼠Thy 1.2陽性的細胞,最終得到含激活DCs的小鼠脾細胞,用DMEM調整細胞濃度到3.0×107 cells/ml。

    1.4  宿主骨髓細胞分選  用1ml注射器使用DMEM沖洗BALB/c宿主動物的股骨和脛骨骨髓腔,收集細胞,離心洗滌一遍,然后用DMEM調整細胞濃度到5.0×106 cells/ml。

    1.5  受者動物的準備  在接受皮膚移植前的第30天,BALB/c受者首先接受900rad致死量的伽瑪射線照射,射線源為北京大學醫學部鈷-60照射室,然后于照射后的6h內,每只BALB/c受者,通過尾靜脈,或者輸入1.0×106骨髓細胞,或者輸入1.0×106骨髓細胞和5.0×106激活的宿主DCs細胞的混合細胞。

    1.6  移植和耐受誘導  在回輸細胞后的第30天,不同處理的BALB/c受者給予同種異體皮片移植,取自小鼠尾巴的皮膚剪裁成大小為0.9cm×0.9cm的皮片[11],如表1所示,接受來自C57BL/6鼠的皮片的動物作為耐受誘導組1,接受來自129鼠的皮片的動物作為特異性對照組3。

    1.7  病理組織學分析  于空白對照組排斥的時間,即皮片移植后第11天取材,取材部位是移植皮片及其周邊0.5cm范圍內的皮膚組織,在北京大學干細胞中心處做石蠟切片,HE染色,光鏡分析。

    1.8  流式細胞分析  分別于皮片移植術后第11、19、23天取移植受者外周血,溶解紅細胞后,使用PE標記抗小鼠CD4抗體和FITC標記抗小鼠CD8抗體,雙標直染;然后使用FACScan (Becton Dickinson)行流式細胞分析外周血CD4+或者CD8+T細胞以及兩者的比例。

    1.9  統計學分析  采用SAS軟件,使用配對t檢驗來比較各組間皮片存活時間差異,P<0.05認為差異有顯著性。

    2  結果

    2.1  致死量照射后宿主動物的免疫造血功能重建  實驗組受者動物(BALB/c鼠)在移植前30天,首先給予致死量伽瑪射線(900rad)照射,同時在6h內通過尾靜脈混合回輸激活的DCs(去除T細胞的脾細胞)和同基因骨髓細胞,或者僅回輸同基因骨髓細胞;隨后受者動物將開始免疫造血功能重建。30天后進行小鼠尾部皮片移植(供者分別為C57鼠和特異性對照129鼠)。在照射后的3個月的觀察期間,各組動物均存活良好。

    2.2  接受回輸激活的DCs的移植模型中,皮片存活時間延長  如表1所示,不同分組間,皮片存活時間存在明顯差異。其中,組0為受者未接受任何特殊處理,直接行皮片移植的結果,其皮片中數存活時間(MST)為11天;組1為受者經致死量伽瑪射線照射后給予激活的DCs和同基因骨髓細胞經免疫造血功能重建30天后,行皮片移植的結果,MST=20天;兩者相比,組1受者皮片存活時間明顯延長,統計學分析為差異有顯著性(P<0.005)。圖1為第11天組0(左)和組1(右)的移植皮片的照片,組0受者的移植皮片完全被排斥脫落,而組1的皮片存活良好;圖2為組1受者移植皮片第15(A),17(B),19(C),21(D),23(E)天的照片,可見第21天前皮片均生長良好,第23天時皮片顏色加深,出現邊緣結痂,排斥的跡象 表1  受者動物給予不同處理后行同種皮片移植、皮片存活時間統計表注:受者鼠在皮片移植前30天給予900rad致死量伽瑪射線照射,同時如表1所示,于照射后6h內回輸不同的細胞。表中MST的計算基于3次不同的實驗結果;*P<0.005組1和組0間;P<0.0001組1和組3間。MST,Median Survival Time,即中數存活時間。DC,指經同種移植激活的樹突狀細胞,即BALB/c小鼠先接受同種皮片移植(供者為C57鼠),10天后取脾細胞,經淋巴細胞分層液分層離心得到單核細胞,并用磁珠標記的抗小鼠pan-T抗體陰性分選去除T細胞后得到的細胞。BMC,為同品系的BALB/c小鼠骨髓細胞

    2.3  激活的DC細胞誘導供者特異性移植耐受  為證實激活的DC細胞誘導的是供者特異性的耐受,我們取無關的供者129鼠的尾部皮片,如表1組3所示,與組1相比,受者的處理完全相同,但皮片來自無關的129鼠,該移植皮片在第10天均被完全排斥,MST=10天,與組1相比,差異有顯著性(P<0.001)。

    相反,供者照射后僅給予骨髓細胞,產生的耐受是非特異性的,如組2、組4所示,受者對C57鼠和129鼠的皮片均產生耐受,兩者MST均達到28天,差異無統計學意義(P>0.05)。

    2.4  移植皮片部位病理組織學分析  如圖3所示,第11天,組0(A),組3(C)受者皮片完全被排斥,鏡下觀察見大量炎癥細胞浸潤,組0(A)皮片和受者移植部位相分離;相反,此時組1(B)皮片生長良好,鏡下見移植皮片和受者移植部位沒有脫離傾向,也未見明顯炎癥細胞浸潤。

    2.5  實驗組的免疫學功能狀態的流式細胞分析結果  分別于皮片移植術后第11、19、23天,取組0、組1移植受者外周血,用流式細胞分析外周血CD4+或者CD8+T細胞以及兩者的比例。如表2所示,于第11天,組0和組1間,CD4+、CD8+細胞以及兩者的比例差異有顯著性;第11、19、23天,CD4+、CD8+細胞以及兩者的比例在組1受者組內差異也有顯著性(P<0.01)。可見在免疫重建過程中,組1的CD4+輔助性T細胞于移植后30天,在比例和絕對數目上已經完全恢復;從CD4+/CD8+細胞比值看,骨髓移植后,比值明顯升高了,一方面是CD4+的T細胞比例增加了,同時,CD8+T細胞比例減少了,CD8+的T細胞減少的幅度超過了CD4+的T細胞增加的幅度,結果CD4+/CD8+的比值,組1與組0相比,增加了3倍左右。在完全排斥的23天,其值達到最高峰(7.87)。表2  流式細胞分析結果注:于第11天,組0和組1間,CD4+、CD8+細胞以及兩者的比例差異有顯著性;第11、19、23天,CD4+、CD8+細胞以及兩者的比例在組1受者組內差異也有顯著性

    3  討論

    皮膚移植是非常嚴格的移植排斥動物模型,皮膚是全身各種器官組織中最容易被排斥的組織,而且皮膚移植直觀,操作相對簡單[11],所以我們選擇它作為動物模型。在不使用系統性免疫抑制劑的情況下,我們在小鼠皮膚移植模型中成功誘導供者特異性免疫耐受,使皮片存活時間明顯延長,對于C57BL/6來源的皮片,其MST達20天;相反,對于無關129鼠來源的皮片,其MST=10天。可能的耐受機制是復雜的:(1)可能是由于經同種移植激活的DCs攜帶供者特異性抗原,經尾靜脈回輸進入受鼠體內,然后隨血液循環歸巢到受者胸腺中,提呈供者抗原參與陰性選擇過程,使受者在免疫重建過程中,大部分供者反應性的T淋巴細胞在胸腺水平經陰性選擇由誘導凋亡克隆清除和克隆無能等機制去除掉,從而誘導對供者皮片的耐受,同時,在免疫重建的過程中,受者能保持對其他抗原的正常免疫應答;(2)也可能是供者抗原進入胸腺后,誘導調節性T細胞Treg細胞對供者產生特異性的免疫耐受。(3)還可能是由于同種移植激活的DCs攜帶供者特異性抗原進入體內后,激活同種反應性T細胞回流入胸腺所致。

    從組3的結果可知,接受了致死量照射的受鼠在經過30天的免疫重建后,于第10天就完全排斥了無關129鼠的皮片,一方面說明該耐受誘導方案的特異性;同時也表明,受鼠具備了完整的免疫功能,流式細胞分析的結果也進一步證實了受鼠的免疫功能,如表2所示,在免疫重建過程中,組1的CD4+輔助性T細胞于移植后30天,在比例和絕對數目上已經完全恢復;從CD4/CD8細胞比值看,由于外周CD4/CD8的比值是由胸腺的微環境決定的,胸腺的輸出對于該比值有決定性的影響,在正常的成年小鼠,其值介于2~4之間[12];骨髓移植后,比值明顯升高了。由于CD4+的細胞識別MHC Class II分子和外源性的抗原肽形成的復合體,因此推斷可能是由于同種激活的DCs攜帶同種異型抗原分子進入胸腺后,一方面通過胸腺的陰性選擇誘導細胞毒性的CD8+T細胞凋亡,因此外周CD8+T細胞的比例減少了近一半;同時,由于該方案誘導的是不完全的耐受,其MST=20天,移植術后不可避免的發生排斥反應,將導致了CD4+的T細胞數目增加,在完全排斥的23天,其值達到最高峰。

    皮膚移植有高排斥性且操作簡單,是良好的移植動物模型,但是在臨床上多為自體皮膚移植,因此,我們也設想在今后的實驗中嘗試心臟移植、腎臟移植等其他的移植模型來進一步驗證實驗結果,期待能對將來的臨床實體器官移植提供更有意義的參考;對于激活的DC細胞呈遞的供者抗原,我們也希望能在今后的實驗中進一步提取、純化,以期待分析誘導移植耐受的優勢表位;同時,我們也在設計進一步的實驗來驗證前文所述的誘導該免疫耐受方案的可能機制。(本文圖片見封三)

    (致謝:感謝北京大學人民醫院肝病研究所的魏來教授,高燕教授提供指導和實驗的部分場所;叢旭老師提供實驗的技術支持)

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       *基金項目:國家自然科學基金資助項目(編號:30471570)

    作者單位: 100083 北京,北京大學醫學部免疫學系(△通訊作者)

   (編輯:秋  實)


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