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古代人類牙齒DNA的提取和擴增條件研究*

來源:中華醫學研究雜志 作者:施琳,曾祥龍 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 以河南洛陽二里頭遺址出土的距今3000多年的夏代人牙齒為標本,從口腔醫學的角度分析牙齒DNA提取的污染控制,并進行PCR擴增條件的比較研究。方法 對古代人類牙齒樣本進行去污處理,放入液氮研磨機中打磨成牙粉,使用GENECLEAN○R Kit for Ancient DNA 試劑盒從牙粉中提取DNA分子。利用不同條件的5種PCR反應......


  【摘要】  目的  以河南洛陽二里頭遺址出土的距今3000多年的夏代人牙齒為標本,從口腔醫學的角度分析牙齒DNA提取的污染控制,并進行PCR擴增條件的比較研究。方法  對古代人類牙齒樣本進行去污處理,放入液氮研磨機中打磨成牙粉,使用GENECLEAN○R Kit for Ancient DNA 試劑盒從牙粉中提取DNA分子;利用不同條件的5種PCR反應體系擴增古DNA。結果  從牙齒樣本中抽提出古代DNA片段A;在PCR擴增中,加入適量的小牛血清蛋白BSA有助于消除古代樣本中PCR抑制物的作用;適合的Mg2+濃度則有助于增加DNA聚合酶的活性,減少非特異性擴增。結論  古DNA試劑盒是一種有效的古DNA抽提方法;小牛血清蛋白BSA和Mg2+濃度對PCR反應存在影響。

    【關鍵詞】  古代人類牙齒;DNA;提取;擴增;小牛血清蛋白; Mg2+

    A study of extraction DNA from ancient teeth and the influences of amplifying conditions

    SHI Lin,ZENG Xiang-long.Peking University  School and Hospital of Stomatology,Beijing 100081,China

    【Abstract】  Objective  To extract DNA from human ancient teeth remains more than 3000-years-old excavated from Erlitou ruin in Henan province,and analyze the pollution control from dental aspect and study the influences of different conditions of PCR.Methods  The teeth were cleaned and grinded into powder by FREEZER/MILL6750. DNA was extracted with ancient DNA extraction kit and amplified under 5 different polymerase chain reaction conditions.Results  DNA was extracted from teeth powder; BSA helps to eliminate the effects of inhibitions; proper density of Mg2+ helps to increase the activity of TaqE and avoid the amplifying errors.Conclusion  Ancient DNA extraction kit is a effective way to extract ancient DNA; BSA and the density of Mg2+  have influences on the results of PCR.

    【Key words】  ancient teeth; DNA; extraction; amplify; BSA; Mg2+

    牙齒是人體中最堅硬的組織,往往可以歷經幾千甚至上萬年而不發生腐敗和解體。DNA分子的片段可以在生物體死亡之后的很長時間內保存。利用現代分子生物學的手段提取留存在古代人類和動植物樣本中的DNA分子,可以直接分析古代樣本中的遺傳信息。本研究作為國家自然科學基金資助項目,從河南洛陽二里頭遺址出土的距今3000多年的夏代人牙齒標本中提取線粒體DNA序列,從口腔醫學的角度分析牙齒DNA污染的控制,并對古代DNA進行PCR擴增條件的摸索和比較。

    1  材料與方法

    1.1  研究對象  本研究所采用的樣本為中國社會科學院考古研究所二里頭工作隊提供的從河南洛陽二里頭遺址出土的夏代人類牙齒三枚,都來自于同一個體。

  本研究樣本選擇標準為:(1)非游離牙齒;(2)牙體完整,無明顯裂紋;(3)牙周狀況良好,無明顯牙槽骨吸收;(4)牙齒所在牙槽骨保存狀況良好;(5)同一個體具有多顆牙齒符合條件。(注:牙周病的判斷參照毛燮均教授1959年研究安陽殷墟人骨牙周病的診斷標準,以牙槽骨的明顯病變為標準,牙槽骨吸收達牙根的1/2者,才視為此病[1]。)

    本研究的牙齒樣本取自保存狀況良好的下頜骨上。

    1.2  研究方法

    1.2.1  樣本處理 

  在從下頜骨上取下用于實驗的牙齒樣本時,要充分考慮到古代骨骼標本比較干燥,脆性大。為防止牙根折斷,暴露牙髓腔,造成污染,取牙時要十分小心。取下單根牙時,做唇舌向輕微晃動牙齒并稍加旋轉。取下多根牙時,只可輕微晃動牙齒不可旋轉,若單純晃動無法將牙齒取下,則磨除部分牙槽骨以去除骨阻力以保證牙齒完整脫出。選擇完整取出的牙齒進行去除表面DNA污染的處理:1N的鹽酸浸泡5~10min,無菌雙蒸水清洗,再用無水乙醇清洗,晾干;用紫外線照射牙樣各側面,每個側面15min。將牙齒放入液氮研磨機FREEZER/MILL6750中打磨成粉。

    1.2.2  提取DNA[2,3]

  使用GENECLEAN○R Kit for Ancient DNA 試劑盒(所有試劑為無核酸污染試劑)提取存在于牙粉中的DNA,用于擴增目的片段。每次抽提均設空白對照。

    1.2.3  古代DNA的擴增 

  抽提得到的是核DNA和線粒體DNA的混合物。本研究的目的片段位于線粒體DNA的高可變一區。這一區域是非編碼區,具有突變速度快,無內含子,插入缺失較少,無重組現象等特點,因此它被廣泛采用作為古DNA研究的目標片段。本研究采用吉林大學生命科學院古DNA實驗室設計的引物來擴增古代個體的線粒體DNA高可變一區的DNA片段,引物設計嚴格遵循引物設計的原則[4]。DNA片段的擴增按Handt[5]的方法進行,操作過程在臺式PCR防污染超凈臺中完成。PCR擴增反應采用12.5 l體系。為探索本研究樣本的最佳PCR條件,研究小牛血清蛋白BSA和Mg2+濃度對擴增結果的影響,分別設計以下幾種不同條件的PCR反應體系。見表1~5。 表1  PCR反應體系1表2  PCR反應體系2表3  PCR反應體系3表4  PCR反應體系4表5  PCR反應體系5 PCR擴增35個循環按以下程序進行:95℃ 5min,94℃變性50s,55℃退火50s,72℃延伸1min,7個循環后進入92℃變性50s,50.3℃退火50s,72℃延伸1min,28個循環后,72℃延伸10min,4℃保持。每次PCR反應均設2個空白對照(擴增及抽提對照)。空白對照中以雙蒸水取代抽提液。

    1.2.4  PCR 結果的電泳觀察 

  擴增結果用2%瓊脂糖凝膠電泳觀察,置于盛有1×TAE電泳緩沖液的水平電泳槽中,對PCR擴增產物進行電泳分析,電壓為5V/cm。使用ImageMaster○R VDS凝膠成像儀進行觀察,分析、記錄。

    2  結果

    2.1  DNA的抽提結果

  本研究從牙齒樣本中提取出了50 l的DNA抽提液。在隨后的DNA擴增反應中,抽提空白對照均為陰性,據此可以初步驗證在提取過程中沒有發生外源性的污染。

    2.2  DNA的PCR擴增結果

  5個PCR反應體系的電泳結果見表6、圖1。表6  5個反應體系PCR擴增結果注:E0 為抽提空白對照;P0 為PCR空白對照;S1A為反應體系5的PCR擴增產物, E0左側為反應體系4的擴增結果,為陰性, 其下方為引物二聚體。反應體系1、2、3電泳圖略

    3  討論

    3.1  關于實驗過程的討論  (1)由于實驗樣本干燥,脆性較大,從下頜骨上取牙時必須十分小心,防止牙根折斷,暴露牙髓腔,造成污染。取下單根牙時,可唇舌側輕微晃動牙齒并稍加旋轉,原理同拔牙。而取下多根牙時,只可輕微晃動牙齒不可旋轉,有時需磨除部分牙槽骨以去除骨阻力保證牙齒完整脫出。(2)取出的牙齒根部牙骨質表面顏色往往深于現代離體牙,這是由于土壤中的腐酯酸、褐菌酸導致了牙骨質的顏色加深,這些物質對PCR反應有抑制作用。經過去污處理的牙齒樣本如果外觀顏色呈現暗黃甚至褐色,往往提示其所含的PCR抑制物較多,不易擴增。如果牙齒呈白堊色,則說明樣本的保存狀況可能不錯,易于擴增。(3)由于PCR反應體系很小,在向管中加樣時要十分小心,盡量將樣直接加至管底,而不要接觸管口,因為這樣極易造成污染。如果加樣時有液體留于管內壁,可通過離心將液珠甩下,使加入的液體能夠充分參加反應。

    3.2  古代DNA的序列真實性[6]  (1)樣本的選擇:本實驗中,用于研究的樣本為牙齒。選取保存狀況良好,牙齒完整,牙冠和牙根無裂紋、破損的樣本用于實驗,以盡量減少引入外源DNA 污染的可能性。(2)實驗區域的劃分:在實驗空間的設計上,將實驗室分隔成幾個區域:樣本處理區→DNA提取區→PCR準備區→PCR區→PCR結果觀察區,實驗中操作者按箭頭的方向在這幾個區域移動,禁止做反向活動。(3)實驗對照組的設置:在實驗過程中,每個PCR反應均設有提取對照和PCR空白對照組。提取對照是指提取過程中,不加入牙粉,其余所有步驟相同,用于觀察提取試劑是否存在污染,PCR空白對照是指加入所有PCR成分只是不加入模板(提取物),而是以雙蒸水補足模板的量,以觀察PCR試劑是否存在污染。

    3.3  PCR反應中的緩沖液  (1)KCl的濃度在50mmol/L下有利于引物的退火,超過50mmol/L的KCl則會抑制酶的活性。(2)BSA(1.3mg/ml)的加入可以幫助去除在抽提液中含有的一些不明成分(可能是腐殖酸、褐菌酸、鞣酸等)對Taq DNA聚合酶的抑制作用,增強酶的穩定性,消除樣本中PCR反應抑制物的作用。(3)Mg2+濃度會影響酶的活性與忠實性,也影響引物的退火,模板與PCR產物的解鏈溫度,引物二聚體的形成等等。一般來說,Mg2+濃度過低,酶活性顯著降低;Mg2+濃度過高,會引起非特異性擴增。一般Mg2+濃度在0.5~2.5mmol/L之間,由于酶需要的是游離的Mg2+,但DNA模板,引物,dNTP的磷酸基團均可結合Mg2+從而降低Mg2+的實際濃度,因此PCR中的Mg2+濃度要比dNTP高出0.2~2.5mmol/L。另外,EDTA等螯合劑也會影響Mg2+濃度。

    4  結論

    古代DNA含量稀少,保存狀況差。采用專門的古DNA試劑盒進行古DNA抽提是一種行之有效的方法,由于實驗過程快速、簡便,處理步驟少,減少了污染的機會。在古DNA的PCR擴增中,加入適量的小牛血清蛋白BSA有助于消除古代樣本中PCR反應抑制物的作用。適合的Mg2+濃度則有助于增加DNA聚合酶的活性,減少非特異性擴增。

    【參考文獻】

    1  毛燮均,顏閻.安陽輝縣殷代人牙的研究報告.古脊椎動物及古人類,1959,1:81-84.

    2  Connie J. Kolman,Noreen Tuross. Ancient DNA analysis of Human populations. American Journal of Physical Anthropology,2000,111: 5-23.

    3  Dongya Y Yang,Barry Eng,John S Waye,J.Christopher Dudar,Shelley R.Saunders. Techical Note:Improved DNA Extraction From Ancient Bones Using Silica-Based Sin Columns.American Journal of Physical Anthropology,1998,105:539-543.

    4  J.薩姆布魯克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南.第三版.北京:科學出版社,2002,387-391,596-611.

    5  Handt O,Richards M. Molecular genetic analyses of the Tyrolean Ice Man. Science,1994,264: 1775-1778.

    6  Connie J Kolman,Noreen Tuross. Ancient DNA Analysis of Human Populations. American Journal of Physical Anthropology,2000,111: 5-23.

     *基金項目:國家自然科學基金資助項目(編號:30271429)

    作者單位: 100089 北京,北京大學口腔醫學院·口腔醫院(△通訊作者)


    (編輯:秋  實)


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