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分子信標實時定量PCR法檢測胃癌中Survivin基因mRNA的表達*

來源:中華醫學研究雜志 作者:鄭紅,孫保存,王立梅,李希,王家倉 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 采用分子信標實時定量PCR方法檢測胃癌樣本中Survivin基因mRNA的表達量,并分析其與臨床資料之間的關系。方法 設計Survivin基因特異性分子信標探針和引物,以cDNA克隆重組質粒為標準品,建立Survivin基因實時定量檢測方法。并檢測胃癌樣本中Survivin基因mRNA的模板拷貝數。結果 Survivin基因mRNA分子信標實......


  【摘要】  目的  采用分子信標實時定量PCR方法檢測胃癌樣本中Survivin基因mRNA的表達量,并分析其與臨床資料之間的關系。方法  設計Survivin基因特異性分子信標探針和引物,以cDNA克隆重組質粒為標準品,建立Survivin基因實時定量檢測方法;并檢測胃癌樣本中Survivin基因mRNA的模板拷貝數。結果  Survivin基因mRNA分子信標實時定量檢測方法的線性范圍為103~1010拷貝數,批間變異為28.16%,批內變異為13.34%,靈敏度為42個拷貝數,平均回收率為109.83%;胃癌組織、癌旁組織和正常組織以及胃良性病變組織間比較,mRNA模板拷貝數差異有顯著性(P<0.05);胃癌樣本中mRNA模板拷貝數與淋巴結轉移和2年生存期以及病理類型相關(P<0.05)。結論  成功建立Survivin基因分子信標實時定量檢測方法。胃癌中該基因表達的模板拷貝數可作為預測淋巴結轉移、評價預后的一個重要指標。

    【關鍵詞】  分子信標;實時定量PCR;Survivin;胃癌

    Real Time PCR detection of Survivin expression by molecular beacon in gastric carcinoma

    ZHENG Hong,SUN Bao-cun,WANG Li-mei,et al.Department of Biochemistry and Molecular Biology,the Cancer Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin   300060,China

    【Abstract】  Objective  To develop a real time fluorescent quantitative method based on molecular beacon technique and quantification of mRNA expression of survivin gene in gastric carcinoma.Methods  A molecular beacon probe and primers were designed and applied in the detection of survivin gene,while recombination plasmid containing the sequence of survivin was standard. The copies of survivin expression were detected in gastric carcinoma,and relationship between copies and clinical data was analyzed. Results  A linear standard curve was obtained between 103 and 1010 copies. The inter-and intra-assay coefficient variation (CV) was 28.16% and 13.34%,respectively. The sensitivity of this assay was 42 copies. The average recovery was 109.83%. The copies of survivin expression were significantly higher in gastric carcinoma than in the other groups (P<0.05). There was a relationship between copies of survivin gene with lymph node metastasis,poor survival and histological types. Conclusion  The method can detect copies of survivin expression. It might be an important indicator in predicting lymph nodes metastasis and evaluating the prognosis.

    【Key words】  molecular beacon; real time PCR; survivin; gastric carcinoma

    實時定量PCR方法是近年發展起來的一種新的PCR定量技術,由于在PCR反應中引入了熒光探針,可以通過檢測擴增過程中熒光信號的有無和強弱來判定目的基因的有無及表達量多少。分子信標(molecular beacon)探針就是其中一種熒光探針,它是在核酸雜交原理和熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)現象的基礎上開發出來的,可用于實時定量檢測基因的表達水平[1,2]。

    Survivin是1997年[3]發現一種特殊結構和性質的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis,IAP),它在終末分化的成人組織中很少表達,而在絕大多數腫瘤細胞中高表達[4~6]。本研究應用分子信標探針實時定量PCR技術檢測了胃癌組織中Survivin 基因的mRNA表達情況,分析其與不同病理類型及臨床資料之間的關系,探討Survivin基因在胃癌的診斷、治療和預后等方面的可行性。

    1  材料與方法

    1.1  標本收集  隨機收集天津醫科大學附屬腫瘤醫院胃腸腫瘤外科2001年11月~2003年11月手術切除的胃癌組織標本69組,每組包括腫瘤組織、癌旁組織、手術切端正常組織三份標本,離體后立即放入液氮中,后轉入-80℃冰箱保存。男38例,女31例;年齡38~86歲,中位年齡56歲;按國際抗癌聯盟(UICC)胃癌TNM分期:Ⅰ期3例,Ⅱ期23例,Ⅲ期29例,Ⅳ期14例;按組織學類型分類:低分化腺癌22例,乳頭狀腺癌2例,管狀腺癌13例,黏液腺癌5例,黏液細胞癌10例,印戒細胞癌2例,混合性癌15例;按分化程度分組:乳頭狀腺癌和管狀腺癌為分化較好組15例,其余為分化較差組54例;按生存期分組:24個月無轉移復發為生存組,有轉移復發或死亡為轉移死亡組。經病理證實的胃良性標本47例,其中胃息肉1例,幽門口潰瘍1例,膽汁反流胃炎1例,球部潰瘍1例,豆疹樣胃炎1例,慢性胃炎42例。

    1.2  定量檢測標準品制備——Survivin基因cDNA克隆  克隆方法如文獻[7]所述,概括如下:取胎兒的脾臟提取總RNA,RT-PCR方法擴增出Survivin基因讀碼框部分cDNA,構建重組質粒。經序列分析證實克隆成功后,小量制備重組質粒,RNase A 消化RNA并純化后,以260nm吸光度值計算含量,根據分子量計算拷貝數;倍比稀釋后作為實時熒光定量檢測的標準品。

    1.3  引物和探針  根據GeneBank中Survivin mRNA序列,通過Oligo6.0分析軟件設計引物和探針(上海生工合成標記)。上游:5′-CCT GGC AGC CCT TTC TCA-3′(75~92),下游:5′-TCA GTG GGG CAG TGG ATG-3′ (178~195),探針:5′-CCG CAT CTC TAC ATT CAA GAA CTG GCA TGC GG-3′ (106~125),其中畫線部分為分子信標探針中與靶序列無關的自身互補序列,斜體部分為Survivin基因探針的互補序列,檢測片段大小121bp;探針的5′端標記熒光基團FAM,3′端標記淬滅基團DABCYL。

    1.4  實時定量檢測  20μl反應體系中加入10μl  PCR SuperMix (Invitrogen公司產品),上、下游引物和分子信標探針各200nM,每管加入不同模板拷貝數的標準品或100 ng待測樣本,補齊體積到20μl。反應條件為50℃溫育2min,95℃預變性2min; 95℃ 20s,60℃ 60s,40個循環。每個標準或樣本重復2次。以每個標準拷貝數的對數為橫坐標,以熒光信號達到設定閾值時所經過的循環數(Ct值)為縱坐標,繪制標準曲線;并以精密度和回收率考證方法;根據被檢測樣品的Ct值,通過標準曲線計算出樣本的模板拷貝數。

    1.5  統計學方法  數據分析使用SPSS11.0軟件包進行。Survivin mRNA的模板拷貝數以均值加減標準差(x±s)表示,模板拷貝數轉換為對數進行統計分析,不同來源的組織樣本間以及腫瘤組織中Survivin模板拷貝數與病理類型間的比較采用方差分析,與臨床參數之間的比較采用獨立樣本t檢驗

    2  結果

    2.1  標準品克隆  經過測序分析并與GeneBank比較,重組質粒的第385位發生堿基改變,由 A變為G,致密碼子編碼由賴氨酸變為谷氨酸。分子信標定量檢測位置在1、2外顯子的第75~195位之間,陽性克隆中堿基的改變并不影響作為定量檢測標準品的使用。

    2.2  實時定量檢測  標準品檢測范圍103~1010個拷貝(見圖1),直線斜率a=-3.2253,截距b=46.2569,相關系數r=0.9954;批內變異為13.34%(n=20),批間變異為28.16%(n=5),回收率為109.83%,實驗中得到的最小檢出量為42個拷貝數。

    2.3  Survivin模板拷貝數與臨床資料及病理類型之間的關系  本研究設定>40個循環仍無熒光信號明顯增加的樣本,Survivin mRNA表達為陰性,數值以“0”計入統計資料。不同組織中Survivin mRNA模板拷貝數的結果見表1,腫瘤組織與其相應的癌旁組織比較差異無顯著性(P=0.076),與正常和良性組織比較差異有顯著性(P=0.000);癌旁與正常和良性組織比較差異有顯著性(P<0.05);正常組織與良性組織比較差異無顯著性(P=0.085)。腫瘤組織中Survivin mRNA模板拷貝數與臨床資料之間的關系見表2,與病理類型之間的關系見表3,結果顯示Survivin mRNA模板拷貝數與性別、年齡、TNM分期以及分化程度無關(P>0.05);與淋巴結轉移、生存期和病理亞型有關(P<0.05)。圖1  標準品的實時熒光定量檢測 表1  實時定量檢測不同組織中mRNA模板拷貝數表3  腫瘤組織mRNA模板拷貝數與病理類型的關系

    3  討論

    分子信標探針是由Tyagi[8]首先建立起來的,它是一種具有“莖環”結構的發夾式探針,莖部分是與目的基因無關的互補序列,環部分是與目的基因互補的序列,探針兩端分別標記熒光基團和淬滅基團。無目的基因存在時,由于探針呈發夾結構,激發光作用時熒光基團吸收的能量通過熒光共振能量轉移傳遞給與之接近的淬滅基團,以熱的形式散失而不產生熒光;當有目的基因存在時,分子信標探針的“環”部分與目的基因互補結合,形成比發夾式探針更穩定的雜交二聚體,此時熒光基團和淬滅基團遠離,在激發光作用下,熒光基團吸收的能量不能傳遞給淬滅基團,從而產生熒光。

  影響分子信標探針構型穩定性的參數有莖環長度之比、莖的長度和GC含量等。首先,環的長度至少應是莖長的2倍以上,才可保證探針與目的基因雜交后,熒光基團與淬滅基團充分遠離。其次,莖的長度應在6~12nt之間,序列中GC含量一般應在50%以上,方能有利于形成比較穩定的發夾結構。另外,定量檢測擴增的片段大小一般應<200bp,最好是在150bp以下,這樣才可忽略擴增效率的差異。本研究所設計的探針莖長6bp,環長20bp,環長是莖長的三倍以上;莖中的GC含量達66.7%(4/6);擴增片段的大小為121bp,完全滿足作為熒光探針進行定量檢測的需要。

  Survivin是IAP家族的重要成員,是迄今發現的最強的凋亡抑制蛋白,其抗凋亡作用遠大于bcl-2家族,與腫瘤的發生發展關系密切。Survivin即可特異性地結合Caspase-3和Caspase-7而阻斷刺激誘導的細胞凋亡過程,同時還可以通過與周期蛋白激酶CDK4結合釋放p21-CDK4復合體上的p21,游離的p21再與Caspase-3結合,從而抑制Caspase-3的活性,阻止細胞凋亡[9]。因此引起了研究者的廣泛注意。目前檢測Survivin基因mRNA表達多采用定性或半定量RT-PCR方法[10,11],得到的是模板經PCR擴增以后的結果,而非原始模板量;原位雜交的方法[12] 所得到的結果是陽性率;即使采用實時定量的方法[13],也是以管家基因作為參比進行相對定量。

  本研究以Survivin基因重組質粒為標準品,測定了胃癌樣本中Survivin基因mRNA絕對模板拷貝數,并分析了拷貝數與臨床資料之間的關系。結果顯示,Survivin基因模板拷貝數與有無淋巴結轉移顯著相關,與2年生存期顯著相關,與病理類型顯著相關。黏液腺癌組與乳頭狀/管狀腺癌組、低分化腺癌組比較,黏液細胞/印戒細胞癌組與低分化腺癌組比較,混合性癌與低分化腺癌組比較,差異有顯著性(P<0.05)。由表3可知:分化較差組的黏液腺癌mRNA表達在幾十個拷貝數,顯著低于分化程度較好的乳頭/狀管狀腺癌組,黏液細胞癌/印戒細胞癌組mRNA表達在幾千個拷貝數,與乳頭狀/管狀腺癌組比較雖無統計學差異(P=0.157),但拷貝數兩者相差幾十倍,這可能與黏液細胞/印戒細胞癌組的變異較大有關。與乳頭狀/管狀腺癌和低分化腺癌比較,胃黏液癌組織中Survivin基因mRNA表達較低,是否與它們之間發生發展的機制不同有關,有待于進一步研究。

  不同臨床分期比較,Survivin基因模板拷貝數無統計學差異,Ⅰ、Ⅱ期組平均值略高于Ⅲ、Ⅳ組。可能是因為Survivin基因的過表達在胃癌的發生、發展過程中是一個比較早期的事件,在初期即發生了重新表達;隨著腫瘤的進展,Survivin基因表達增強,其自身存在的負性變異體Survivin-2B[14]以及其下游基因被激活,抑制Survivin基因的進一步表達。不同分化程度組間比較同樣無統計學差異,由表2可知,分化程度較差組模板拷貝數低于分化程度較好組,如將分化程度較差組進一步分為黏液癌組和低分化腺癌組,三者之間比較差異有顯著性(P=0.002)。

  總之,胃癌樣本不同病理類型中Survivin基因mRNA表達的模板拷貝數存在差異,低分化腺癌最高,乳頭狀/管狀腺癌次之,黏液癌較低;有淋巴結轉移表達高于無淋巴結轉移;2年轉移死亡者表達高于未轉移復發者,可成為評估胃癌的生物學行為及判斷預后的指標。

    【參考文獻】

    1  Drake TJ,Tan W. Molecular beacon DNA probes and their bioanalytical applications. Appl Spectrosc,2004,58:269-280.

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    3  Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.  A novel anti-apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma.  Nature Med,1997,3:917-21.

    4  Yu J,Leung WK,Ebert MP,et al. Increased expression of surviving in gastric cancer patient and in first degree relative. Br J Cancer,2002,81:91-97.

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    9  Suzuki A,Ito T,Kawano H et al. Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death. Oncogene,2000,19,1346-1353.

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    13  Weikert S,Schrader M,Christoph F,et al. Quantification of survivin mRNA in testes of infertile patients and in testicular germ cell tumours: high levels of expression associated with normal spermatogenesis. Int J Androl,2005,28:224-229.

    14  Krieg A,Mahotka C,Krig T,et al.  Expression of different survivin variant in gastric carcinomas: first clues to a role of survivin-2B in tumour progression.  Br J Cancer,2002,86:737-743.

      *基金項目:教育部重點項目(地方01006)

    作者單位:300060 天津,天津醫科大學附屬腫瘤醫院生化與分子生物學室(Δ病理室,ΔΔ胃腸外科)

   (編輯:宋  冰)


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