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革蘭陰性桿菌產Ampc酶誘因探討及其院內分布監測

來源:中華醫學研究雜志 作者:林立中, 孫潔, 楊翠云, 夏先考 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 探討Ampc酶與三代頭孢及其用藥時間長短的關系。統計高產Ampc酶菌株在院內檢出分布的情況,達到指導臨床合理用藥。方法 利用頭孢西丁初篩試驗、三維確證試驗。檢測受試菌Ampc酶的產生情況。...


    【摘要】  目的  探討Ampc酶與三代頭孢及其用藥時間長短的關系;統計高產Ampc酶菌株在院內檢出分布的情況,達到指導臨床合理用藥。方法  利用頭孢西丁初篩試驗、三維確證試驗。檢測受試菌Ampc酶的產生情況;采用肉湯稀釋漸進突變法,對耐藥突變株進行選擇,回顧性比較感染高產Ampc酶株及非高產Ampc酶株的患者。本次感染使用三代頭孢時間上的差異;統計高產Ampc酶菌株在各科室的分布情況。結果  CAZ(頭孢他啶)和CTX(頭孢噻肟)對持續高產突變株的選擇能力最強;CFE(頭孢比肟)選擇性較弱;IMP(亞安培蘭)無選擇性; 革蘭陰性桿菌產Ampc酶的總檢出率為15.1%;初篩試驗與確證試驗的總符合率68.0%;陰溝桿菌產Ampc酶的總檢出率35.1%;初篩試驗與確證試驗的符合率59.1%;綠膿桿菌產Ampc酶的總檢出率80%;初篩試驗與確證試驗的符合率69%;鮑曼不動桿菌產Ampc酶的總檢出率11.0%;初篩試驗與確證試驗的符合率48.1%;大腸桿菌產Ampc酶的檢出率3.5%;初篩試驗與確證試驗的符合率25.6%。感染高產Ampc酶菌的患者三代頭孢平均用藥時間(7.72±1.57)天(3~21天);感染非高產Ampc酶菌的患者三代頭孢平均用藥時間(2.91±0.5)天(0~11天);經t檢驗P>0.05; 高產Ampc酶菌主要科室分布: ICU 19.5%,外科14.4%,血液腫瘤科14.3%,呼吸科10.2%。結論  不同抗生素對高產Ampc酶突變株的選擇性不一樣,感染高產Ampc酶株的患者,用藥時間顯著性長于感染非高產Ampc酶株的患者;我院革蘭陰性桿菌高產Ampc酶菌的總檢出率,初篩試驗與確證試驗符合率,均高出國內平均報道水平[3,4];三代頭孢頻繁使用的科室,高產Ampc酶菌株所占的比例大;這對臨床用藥有重要參考意義。

  【關鍵詞】  突變;  Ampc酶;   革蘭陰性桿菌
   
  Investsation of reasons of Gram-negative bacilli with H-Ampc and their distribution patterns in hospital

  LIN Li-zhong,SUN Jie,YANG Cui-yun,et al.

  The People’s Hospital of Changde City,Hunan 415003,China

  【Abstract】  Objective  To investigate the relationship between the Gram-negative bacilli and how much that will produce Ampc and the induceable reasons including the kinds and using time of third generation cephalosporins else,to investigate the H-Ampc isolates whose distribution patterns and positive rate in our hospital,in order to select antibiotics correctly according to the results.Methods  Detect the Ampc β-lactamase producting statues of Gram-negative bacilli with modified three dimensional test and screening test,the strains were subcultured daily with the tested antibiotics at doubling concentrations starting at 0.25 MIC,to certified weather there are some differences of the third generational β-lactam antibiotics,after high level Ampc-β-lactamase and nor-high level Ampc-β-lactamase Gram-negative bacilli isolated;we compare the using time of every patien to certified if there are some significant differences and statistics distribution of Gram negative bacilli whth high Ampc in all the departments in our hospital。Results  CAZ and CTX exhibited the highest potential to select depressed mutants from strains,CEF showed low potential to select depressed mutants  IMP failed to select it;the total positive rate of Ampc euzyme was 15.1% and  68.0% fits between screening test and confirmatory test;the rate of Ampc enzyme in Enterobacter cloacae,Pseudomonas aeruginosa,Acinetobacter baumanii, E.coli was 35.1%,80%,11.0%,3.5%,and the fits rates between screening test and confirmatory test was 59.1%,69%,48.1%,25.6% respectively; Statisticsed the third generaltional β-lactam antibiotics using time between H-Ampc and N-HAmpc,the first was 7.72±1.57d(3-20) the later was 2.91±0.5d(0-11),the mainly  distribution of Gram-negative bacilli whih HAMPC;ICU,the department of surgery, the department of hematology,the department of respiratory system was 19.5%, 14.4%, 14.3%, 10.2% respectively. Conclusions  there are no same potential to select mutants for every antibiotics,there are significant diffrence of use time between H-Ampc and N-HAmpc,there are more positive rate than other hospitals in our country, more usual use and more positive rate, according to the results it is necessary for antibiotics use.

  【Key words】  mutant;   Ampc enzyme;   Gram-negative bacilli

  目前,臨床常用三代頭孢及其酶抑制劑合成產品治療革蘭陰性桿菌引起的感染;除傳統染色體介導的產Ampc酶革蘭陰性桿菌大量存在外;質粒介導的產Ampc酶株陸續發現,進一步加強了耐藥株在院內流行[1];而國內外對臨床如何治療產Ampc酶的革蘭陰性桿菌引起的感染尚無定論;主要因三代頭孢不僅誘導革蘭陰性桿菌高產Ampc酶,降低療效;而且對Ampd基因突變產生的持續(去阻礙型)高產Ampc酶具有強選擇型,一旦形成持續高產Ampc酶菌株,會對單酰胺類。三代頭孢及其酶抑制劑合成產品產生耐藥[2]。因此,對耐藥原因的分析,Ampc酶的檢測都有重要的臨床意義,為此我們從臨床標本中分離出896株革蘭陰性桿菌進行Ampc酶的初篩試驗與確證試驗,選出23株原單純易誘導型陰溝桿菌,進行突變選擇,回顧性比較感染高產與非高產Ampc酶株患者在使用三代頭孢時間上的差別;統計高產Ampc酶菌株各科室分布情況。現將結果報告如下。

  1  材料與方法

  1.1  菌株來源  2004~2005年我院896株臨床分離革蘭陰性桿菌,其中有常見的大腸桿菌、陰溝桿菌、不動桿菌;質控標準株:E.coli.ATCC 25922 E.cloacae029   E.cloacae 029 M(為持續高產陽性對照)。

  1.2  培養基、藥敏紙片、抗生素藥粉  由杭州天和生物制劑公司提供。

  1.3  研究方法

  1.3.1  耐藥突變株的選擇方法[5,6]  選擇培養基為含適當抗生素的MH肉湯,菌量(4~8)×106 CFU/ml 35℃孵育過夜,選擇過程為7天;抗生素濃度第1天為1/4mic;遂日2倍遞增,至第7天為16mic。

  1.3.2  Ampc酶檢測的初篩試驗  采用紙片擴散法進行初篩,以fox(30μg)藥敏紙片檢測受試菌,根據nccls標準抑菌圈直徑,≤17mm提示對fox中介或耐藥,疑為產Ampc酶株。

  1.3.3  酶粗提物的制備  挑取數個菌落于2ml MHB中,35℃24h培養次日取20μl加入5ml新鮮MHB中,置35℃18h,然后5000r/min 4℃離心30min 棄去清液收集細菌,用0.1M pH 7.0 PBS洗1次。重懸于5ml 0.01M pH7.0 PBS中在冰-水浴條件下超聲波破壁(900W,3min),14000r/min,4℃離心1h,上清液置于-20℃備用。

  1.3.4  頭孢西丁三維確證試驗  參照coudorn[5]等報道的酶提取物。三維試驗方法作了部分改進。按標準的K-B法操作:將0.5麥氏單位E.coliATCC 25922勻涂M-H;取30μg fox(頭孢西丁)置于平皿中心,使用自動割刀片在離紙片邊緣5mm處放射性地由里向外切割一道狹縫(15mm×1mm),用加樣器加入40μl酶粗提物,將培養基35℃過夜,若觀察到狹縫與抑菌圈1/4交接處出現擴大長菌區域,視為三維試驗陽性,說明粗酶中有Ampc酶。

  1.3.5  統計學方法  采用SAS8.2軟件,對用藥時間進行t檢驗。

  2  結果

  2.1  不同細菌Ampc酶總檢出率  Ampc酶總檢出率15.1%,初篩與確試驗的符合率為68.0%。見表1。

  2.2  在耐藥突變株的選擇中不同藥物在不同時間出現的選擇耐藥突變株  見表2。

  2.3  對微生物室分離出的感染高產Ampc酶株的患者和非高產Ampc酶株的患者  在其他因素無顯著差別的情況下,進行臨床三代頭孢及其酶抑制劑合成產品使用時間上的回顧性調查分析,結果:高產Ampc酶患者136例,平均使用時間(7.72±1.57)天(3~20天);非高產Ampc酶患者230/760例,使用時間(2.91±0.53)天(0~11天)。兩組對照用藥時間進行t檢驗,P>0.05,差異有顯著性。

  表1  不同細菌Ampc酶總檢出率(略)

  表2  不同藥物在不同時間出現的選擇耐藥突變株(略)

  2.4  主要科室高產AMPC酶菌株的分布情況  ICU 19.5%,外科14.4%,血液腫瘤14.3%,呼吸10.2%;顯然使用率高的科室分布廣。

  3  討論
  
  耐藥突變株的選擇中,CAZ、CTX選擇性最強;CFP最弱;IMP未選擇出突變株。可見用三代頭孢及單酰胺類治療產誘導酶的陰性桿菌,易篩選出高產Ampc酶的耐藥株,特定地在院內流行;故慎用三代頭孢及其合成劑。四代頭孢與Ampc酶親合力低,快速通過外膜屏障與PSP結合將菌殺死;適合于臨床使用。但四代頭孢選擇的高產Ampc酶菌株,對四代頭孢耐藥,因其伴有外膜蛋白OMP39-40的減少或缺失[7],IMP無選擇性,也無耐藥性增強; 可作為臨床較好的選擇。本院高產Ampc酶菌株總陽性率高達15.1%,用藥頻率高的科室所占比例大,應引起臨床注意。既往研究表明Ampd的突變頻率高達10-5~10-8;因β-內酰胺抗生素對突變的選擇性,感染患者長期用藥,篩選高產Ampc酶株幾率增大,這就提示:較長時間不合理使用β-內酰胺類抗生素是導致高產Ampc酶菌的主要因素。微生物工作者應向臨床多宣傳,且使用過程中須對耐藥進行密切監測。并建議3~5天后重新檢驗感染菌的藥敏試驗。

  【參考文獻】

  1  吳偉元,陳民鈞,陰溝腸桿菌Ampd基因突變去阻礙持續高產Ampc酶.中國抗感染化療雜志,2001,1(2):65-69.

  2  徐升強,詹.腸桿菌科細菌產AMPC酶檢測及耐藥性分析.江漢大學學報,2004,32(2):30-32.

  3  汪亞萍,應春妹.革蘭陰性桿菌Ampc酶的檢測及分析.檢驗醫學,2004,19(5):390-392.

  4  張樂海,傅云霜.雙抑制劑擴散協同法檢測兩種超廣譜β-內酰胺酶.中華檢驗醫學雜志,2001,24(4):211-213.

  5  Coudron PE,Moland ES,Thomson KS.Occurrence and detection of Ampc Betta-lactamases among Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae and protens mirabilis isolates at a veterans medical center. J Clin Microbiol, 2000,38:1791-1796.

  6  Fung-tome JC, Gradelski E, Hcczkoe, et al.Diffrences in the resistant variants of Enterobacter cloacae selected by extended-spectrum cephalosporins.Antimicrob Agents Chemother, 1996,40:1289-1293.

  7  Barnaud G.Antimilrob Agents Chemother, 1997,41:2177-2183.

  (編輯:悅  銘)

  作者單位: 415003 湖南常德,常德市第一人民醫院檢驗科


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