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針刺對抑郁癥模型大鼠海馬區單胺類神經遞質的影響

來源:中華醫學研究雜志 作者:張建斌,王玲玲,呂梅,劉蘭英,利達 2006-8-19

摘要: 【摘要】目的 觀察針刺對抑郁癥模型大鼠的作用機制。方法 選擇Open-Field法評分相近的40只成年SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、藥物組、針刺組,每組各10只。應用分養和長期不可預見性中等強度應激造成抑郁癥模型大鼠。以Open-Field法對照研究針刺對慢性應激誘導的抑郁癥模型大鼠行為學的改變。...


  【摘要】目的 觀察針刺對抑郁癥模型大鼠的作用機制。方法   選擇Open-Field法評分相近的40只成年SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、藥物組、針刺組,每組各10只。應用分養和長期不可預見性中等強度應激造成抑郁癥模型大鼠。以Open-Field法對照研究針刺對慢性應激誘導的抑郁癥模型大鼠行為學的改變;應用高效液相電化學檢測儀檢測單胺類神經遞質。結果   針刺組大鼠,在治療第7天的行為學評分與正常對照組之間已經無明顯差異(P>0.05);在治療21天時,與藥物氟西汀組行為學評分無明顯差異(P>0.05),與模型對照組大鼠差異存在顯著性(P<0.01)。而在治療21天后,針刺組大鼠海馬內5-HT和NE的含量,與正常組差異無顯著性(P>0.05);與模型對照組比較,差異存在顯著性(P<0.05,P<0.01)。結論   針刺治療抑郁癥模型大鼠的行為學異常,其療效與氟西汀相當;抑郁癥模型大鼠海馬區5-HT和NE的含量與Open-field評分存在相似性;針刺療效與海馬區單胺類神經遞質的改變有關系。
     
  【關鍵詞】針刺治療;抑郁癥;疾病模型;大鼠;行為學;5-HT;NE
     
  Effects of acupuncture on serotonin and norepinephrine  in hippocampus of  depressed model rats

  ZHANG Jian-bin,WANG Ling-ling,LV Mei,et al.

  The Chinese Traditional Medical University,Nanjing,Jiangsu 210009,China

  【Abstract】Objective   To observe how acupuncture affects the mechanism of depression model rats.Methods   Using Open-Field method to randomly select 40 adult SD male rats into normal control, model group, drug treatment and acupuncture treatment group, 10 rats per group.  Separation, long term unpredictability, medium stimulation techniques were applied to modify rats behavior. Then using Open-Field method to reflect changes in depressed model rats behavior between groups treated with acupuncture and control. And the concentration of monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampus of rat brain were determined by HPLC-ECD. Results   Compared with normal control, acupuncture treatment group’s behavior was not different (P>0.05)on the 7th day after treatment. On the 21th day after treatment, acupuncture treatment group’s behavior was not different (P>0.05)with drug treatment group, and was more different with model group(P<0.01). Compared with normal group on the 21th day of treatment, the concentration of serotonin and norepinephrine in hippocampus of acupuncture treatment group was not different (P>0.05), whereas was more different with model group (P<0.05,P<0.01).Conclusion   This experiment proved that acupuncture treatment could change the behavior abnormality of depressive model rats. The curative effects is comparable to flouxetine.  The changes of the concentration of serotonin and norepinephrine in hippocampus are one of the mechanism.

  【Key words】acupuncture treatment;depression;disease model;rat;behavior;5 hydroxytryptamine (5-HT);NE

  自1984年,針灸開始介入抑郁癥的治療以來,取得了確切的臨床療效,但是對于針刺作用的過程和機制研究尚不深入。為了探討針刺在抑郁癥治療中的應用規律,我們觀察了針刺對抑郁癥模型大鼠海馬區內單胺類神經遞質的影響,并與氟西汀(選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑)作對照。現將研究結果報告如下。

  1  材料與方法

  1.1  動物與分組  

  成年SD大鼠,體重180~220g,雄性,南京中醫藥大學動物中心提供。首先用Open-Field法作行為學評分,選擇得分相近的40只大鼠進行實驗分組。將大鼠隨機分為正常組、模型組、藥物組、針刺組,共4組,每組10只;正常組每籠飼養5只,模型組及針刺組每籠飼養1只(分養)。

  1.2  實驗方法

  1.2.1 復制模型  

  參考文獻[1]復制抑郁癥模型:模型組、藥物組、針刺組大鼠,共接受21天各種不同的應激,包括冰水游泳(4℃,5min)、熱應激(45℃,5min)、禁水(24h)、夾尾(1min)、電擊足底(電壓50mV,每隔15s刺激1次,每次持續10s,共15次)、搖晃(1次/s,5min)、禁食(24h)和晝夜顛倒等刺激,平均每種刺激各4次。正常組,常規飼養,不接受任何應激性刺激。
   
  于實驗第1、21天測定各大鼠行為學(水平運動和垂直運動)。

  1.2.2  治療方法(實驗第21天,進入治療階段)  

  正常組,繼續常規飼養,每籠飼養5只。模型組,繼續分養,每籠飼養1只;常規飼料喂養,不予應激性刺激,也不予任何治療措施。藥物組,繼續分養,每籠飼養1只;常規飼料喂養,不與應激性刺激,按照1.8mg/kg給予氟西汀,將藥物溶解于生理鹽水中灌胃。1日1次治療,連續21天。針刺組,根據《實驗針灸學》[2]大鼠穴位定位方法,選擇百會、內關、三陰交,并參照人和動物的穴位解剖結構特點,在華興邦研制的大鼠針灸穴位圖譜基礎上,在大鼠前正中線上,額頂骨縫交界線前方處定位神庭穴。針刺方法:常規穴位消毒,選用蘇州醫療用品廠生產的“華佗”牌32號1.0寸針灸針進行治療。百會穴向前斜刺,神庭穴向上斜刺,進針深度約為2mm,內關直刺1mm,三陰交直刺5mm,每穴行均勻捻轉刺激30s,留針10min。1日1次治療,連續21天。
   
  分別于實驗第28、35、42天測定各鼠行為學的變化。

  1.3 行為學測定  

  Open-Field法[3]測定大鼠行為學。本實驗所用敞箱為正方形,長、寬各80cm,高40cm,底面由面積相等,邊長16cm的正方形25塊組成,白色內面,以動物穿越底面的塊數為水平活動(crossing)得分,以直立次數為垂直活動(rearing)得分,每次3min。

  1.4   高效液相-電化學(HPLC-EC)技術與單胺類神經遞質的檢測

  1.4.1 試劑      

  去甲腎上腺素酒石酸鹽(NE)、5-羥色胺鹽酸鹽(5-HT)、3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇(MHPG)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)(以上為SIGMA公司產品),乙二胺-四乙酸二鈉(EDTA)(分析純,汕頭金砂化工廠,批號:010304)、辛烷基磺酸鈉(東京化成工業株式會社,批號:A87509A)、無水乙酸鈉(分析純,南京化學試劑廠,批號:971142)、檸檬酸(分析純,上海榮潤化工有限公司,批號:20010630)、二正丁胺(化學純,中國常州市光明生物化學研究所,批號:960308)、高氯酸(分析純,上海桃浦化工廠,批號:0710)、甲醇(一級品,高效液相色譜專用,江蘇淮陰塑料制品廠精細化工研究所,批號:980512),實驗用水為重蒸餾水。

  1.4.2  儀器  

  高效液相色譜儀由島津LC-10A系列組成,LC-10AD泵,SIL-10A自動進樣器,進針深度35mm,樣品注射速度5μl/s,CTO-10AVP柱溫箱,溫度18℃,壓力為160Kgf/cm2。L-ECD-6A電化學檢測器,CLASS-LC10 VER 1.63工作站。色譜柱為Lichrospher C18, 4.6mm×250mm,江蘇漢邦科技有限公司生產。

  1.4.3 流動相的配備[4]  

  流動相為乙酸鈉(100mmol/L)-檸檬酸(85mmol/L)緩沖液,pH 3.7,內含0.4mmol/L二正丁胺,1.09mmol/L辛烷磺酸鈉,0.2mmol/L  EDTA,及18%甲醇,真空抽濾,超聲脫氣15min后使用。流速為0.5ml/min。

  1.4.4  樣品制備及測定      

  實驗第42天(治療21天)后,斷頭處死大鼠,快速取大腦組織,并置于冰皿上,按Glowinski法分離下丘腦[5],稱重后加入0℃~4℃高氯酸提取液330μl(含0.01%半胱氨酸和0.5mmol/L EDTA)以及內標溶液(DHBA0.006mg/ml)20μl,冰浴中勻漿,4℃高速離心(10000r/min),取上清液注入HPLC-EC檢測系統測定單胺類神經遞質及其主要代謝產物的含量,進樣量為20μl。用內標法定量,峰面積計算含量。共檢測出2種單胺類神經遞質,其洗脫順序依次為:(1)去甲腎上腺素(NE);(2) 5-羥色胺(5-HT)。

  1.5   統計學方法      

  以均數加減標準誤(x±s)表示,統計分析用SPSS12.0統計軟件處理。

  2  結果與分析

  2.1  各組大鼠Open-Field法行為學測定結果      

  Open-Field法是測定抑郁癥大鼠行為學的經典方法,分水平運動和垂直運動兩個觀察面,以觀察得分為評分計算單位。各組大鼠的水平運動評分見表1,垂直運動評分見表2。表1   各組大鼠Open-Field法行為測定水平運動評分結果(略) 注:與正常對照組比,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型對照組比,*P<0.05,**P<0.01表2   各組大鼠Open-Field法行為測定垂直運動評分結果(略) 注:與正常對照組比,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型對照組比,*P<0.05,**P<0.01

      結果表明:(1)在造模結束時(實驗第21天),與正常對照組比較,模型對照組以及各治療組大鼠的水平和垂直運動明顯降低(P<0.01);模型對照組與各治療組大鼠的水平活動和垂直運動差異無顯著性。(2)在治療第7天(實驗第28天)后,針刺組大鼠的行為學評分明顯升高,與正常對照組已經無明顯差異(P>0.05);藥物治療組與正常組大鼠行為學評分相比,尚存在明顯差異(P<0.01),與模型組行為學評分差異無顯著性(P>0.05)。(3)在治療21天(實驗第42天)后,針刺組和藥物治療組行為學評分與正常組大鼠已經差異無顯著性(P>0.05);與模型對照組比較,水平運動和垂直運動差異有顯著性(P<0.01)。(4)在治療21天后,針刺治療組大鼠與氟西汀藥物治療組大鼠的行為學評分差異無顯著性。

  2.2   各組大鼠海馬區單胺類神經遞質的測定結果  

  應用高效液相電化學方法測定各組大鼠海馬區內單胺類神經遞質及其代謝產物的含量。我們在實驗第42天,處死大鼠去大腦海馬組織進行高效液相電化學檢測,僅檢測到海馬區內5-HT和去甲腎上腺素的含量;5-HT的代謝產物5-HIAA和NE的代謝產物MHPG以及DA和它的代謝產物DOPAC,均沒有檢測到。5-HT和NE的含量見表3。表3   各組大鼠海馬區單胺類神經遞質的測定結果(略)注:與正常對照組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

  結果表明:(1)與正常對照組相比,模型對照組大鼠海馬5-HT和NE降低(P<0.01)。(2)經過21天治療,與模型對照組相比,藥物氟西汀治療組和針刺治療組大鼠海馬內5-HT和NE含量明顯升高(P<0.05,P<0.01);與正常對照組差異無顯著性(P>0.05)。(3)各組大鼠海馬區內5-HT和NE的比值,差異無顯著性(P>0.05)。

  3  討論

  關于抑郁癥的病因和發病機制尚不確切。一般認為,本病的發生除了與心理-社會因素和遺傳因素有關外,主要還由于患者腦內單胺類神經遞質減少、相應受體的敏感性改變以及遞質系統間失衡等因素有關。許多研究報告發現,抑郁癥患者存在生物胺水平和(或)生物胺神經通路功能乃至結構的異常,而NE和5-HT被認為與情感障礙的發生關系最為密切;另一方面,NE和(或)5-HT再攝取抑制劑至今仍然是抗抑郁藥的主體。其中,氟西汀是第一個選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs),也是至今應用最廣的抗抑郁藥。研究資料表明[6]氟西汀有抑制神經元從突觸間隙攝取5-HT、增加間隙中可供實際利用的5-HT,從而改善5-HT能神經元的功能狀態而改善情感癥狀;同時,可以通過5-HT和NE能神經元之間的交互作用,影響和調節NE神經元功能、增加突觸間隙NE含量而發揮抗抑郁作用。而另一方面,大腦內不同區域的功能存在差異,其中海馬是邊緣系統的重要組成部分,和情緒及動機的產生以及和腦的高級神經活動——學習記憶有關。海馬還與額葉皮質、皮層下杏仁復合體、紋狀核及下丘腦后部等有復雜的纖維聯系;也是Papez情緒動機回路的一個重要環節[7]。應用核磁共振技術發現,與正常人相比,正在患抑郁癥的患者左、右兩個海馬區的體積明顯減小,直接提示了抑郁癥與海馬區的關系[8]。

  針灸對抑郁癥的治療有確切的療效。從我們的實驗結果來看,針刺治療可以顯著地改善抑郁癥模型大鼠的行為學異常,治療21天時達到正常組大鼠的水平(P>0.05),與氟西汀治療相當(P>0.05),而與模型對照組的水平運動和垂直運動評分存在明顯的差異(P<0.01)。但是從治療過程來分析,針刺組大鼠的行為學評分首先得到改善,而且在治療的第1周就已經與正常組大鼠差異無顯著性。顯現了針刺治療抑郁癥存在某種獨特的機制,提示針刺治療與藥物(氟西汀)治療在機制上可能存在明顯的差異,針刺治療有起效快的特點。本研究還提示,在深入探索針刺治療抑郁癥的神經生物學機制時,可能需要考慮觀察的時間窗等因素,尤其是在治療的早期和超早期。

  我們的研究發現抑郁癥模型大鼠海馬區NE和5-HT含量降低,而通過21天治療后,針刺組和氟西汀組海馬區NE和5-HT的含量都升高,與模型對照組存在明顯差異(P<0.05,P<0.01),而與正常對照組差異無顯著性(P>0.05),提示了針刺抗抑郁的作用與海馬區、尤其是海馬區NE和5-HT神經元功能改善有關。但是進一步的研究,還需要考慮海馬區5-HT和NE等單胺類神經遞質的動態變化規律,以及遞質對應的受體功能和結構改變、受體之間交互作用等變化。

  【參考文獻】

  1 Willner P, Towell A, Sampson D, et al. Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress and its restoration by a tricyclic antidepressant. Psychopharmacology, 1987,93(3):358-364.

  2 李忠仁.實驗針灸學.北京:中國中醫藥出版社,2003,360.

  3 Katz RJ, Roth KA, Carroll BJ. Acute and chronic stress effects on open field activity in the rat:implications for a model of depression.Neuroscience Biobehavioral Reviews, 1981, 5:247-251.

  4 袁淑蘭,阮金秀,楊曉敏. 雙柱雙泵高效液相色譜電化學檢測器測定大鼠腦中生物胺及其代謝產物. 中國藥理學與毒理學雜志,1990,4(1):4-7.

  5 Glowinski J, Iversen LL. Regional studies of catecholamines in the rat brain:1.the disposition of [3H] norepinephrine, [3H] dopamin and [3H] dopa in various regions of the brain. J Neurochem,1966,13:655.

  6 Wong DT, Bymaster FP, Engleman EA . Prozac (fluoxetine, Lilly 110140), the first selective serotonin reuptake inhibitor and an antidepressant drug: twenty years since its first publication. Life Science,1995, 57: 411-441.

  7 Joseph R. Enviromental influences on neural plasticity, the limbic system, emotional development and attachment:a review.Child-Psychiatry-Hum-dev.1999,29:189-208.

  8 杜占文.解讀抑郁癥.國外科技動態,2000,10(375):14-15.

  基金項目:江蘇省教育廳自然科學研究計劃(編號:03KJA360093);南京中醫藥大學針藥結合實驗室(江蘇省針灸學重點實驗室)開放課題(編號:KJA200505)

  作者單位:210009 江蘇南京,南京中醫藥大學針藥結合實驗室 
 


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