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新型增殖性腺病毒治療肝癌的實驗研究

來源:中華醫學研究雜志 作者:楊家和,段紀成,錢其軍,沈麗,丁光輝,吳孟超 2006-12-18

摘要: 新型增殖性腺病毒治療肝癌的實驗研究(pdf) 【摘要】 目的 構建攜帶p53基因增殖性腺病毒CNHK600-p53載體,研究其對肝癌細胞株抑制效應是否優于Ad-p53。方法 實驗分為兩組,單用CNHK600-p53組和單用Ad-p53組。采用四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyl tetrazolium assay, MTT),觀察兩組對肝癌細胞株的殺傷效應。結果 單用C......


  新型增殖性腺病毒治療肝癌的實驗研究(pdf)

    【摘要】  目的  構建攜帶p53基因增殖性腺病毒CNHK600-p53載體,研究其對肝癌細胞株抑制效應是否優于Ad-p53。方法  實驗分為兩組,單用CNHK600-p53組和單用Ad-p53組;采用四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyl tetrazolium assay, MTT),觀察兩組對肝癌細胞株的殺傷效應。結果  單用CNHK600-p53組較單用Ad-p53組肝癌細胞株細胞抑制率高;但當細胞抑制率達到80%以上時,兩組之間差異無顯著性,統計分析采用率的U檢驗。結論  較Ad-p53相比攜帶p53基因的CNHK600-p53能更有效抑制肝癌細胞株,CNHK600-p53可望成為肝癌基因治療的新方法。

  【關鍵詞】  基因;p53; 肝腫瘤; 基因療法

  The effect of new type replicating adenovirus on the treatment of hepatocarcinoma cell line

  YANG Jia-he, DUAN Ji-cheng, QIAN Qi-jun,et al.

  Department of Comprehensive Treatment Ⅲ,Eastern Hepatobilillary Surgery Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200438,China

  【Abstract】  Objective  To construct a replicating adenovirus vector CNHK600-p53 which carried the anti-tumor gene p53,then investigate its inhibition effect is better than Ad-p53 on hepatocarcinoma cell line.Methods  The subject is divided into two groups:single CNHK600-p53 group and single Ad-p53 group. The methylthiazolyl tetrazolium assay (MTT)method was used to observe the killing effect of hepatocarcinoma cell line.Results  The single CNHK600-p53 group’s inhibition rate is higher than single Ad-p53 group; But when inhibition rate is about to 80%, there are no difference in two groups. The data are analysed by U test.Conclusion  Contrast to Ad-p53, adenovirus CNHK600-p53 is more effective  in inhibition to hepatocarcinoma cell line. CNHK600-p53 may be an new gene method for hepatocarcinoma.

  【Key words】  gene;p53;hepatocarcinoma;gene therapy   

  p53基因是重要的腫瘤抑制基因,與腫瘤的發生、發展以及預后關系密切。已證明超過50%以上的腫瘤存在p53基因的異常,且發現p53 基因的突變可能與腫瘤的耐藥性密切相關[1],因而p53基因導入成為重要的腫瘤基因治療手段,也可能是解決腫瘤耐藥性的方法之 一。本實驗構建攜帶p53基因增殖性腺病毒CNHK600-p53載體,研究其對肝癌細胞株抑制效應是否優于Ad-p53。

  1  材料與方法

  1.1  材料  293細胞、腺病毒載體pUC19購自加拿大MICROBIX BIOSYSTEMS公司;腺病毒載體pClon17、腺病毒載體CNHK600、腺病毒載體ppE3本室構建;限制性內切酶、胎牛血清、DMEM和Lipofectamine2000試劑盒購自Gibco公司;Taq酶、pfu酶購自MBI公司; T4 DNA連接酶購自PROMEGA公司;瓊脂糖、溴化乙錠購自GENE公司;膠回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒、質粒DNA制備試劑盒和病毒DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司;人肝癌細胞株BEL-7402、人肝癌細胞株QGY-7703購自中國科學院上海細胞生物學研究所,人肝癌細胞株PLC/PRF5、人肝癌細胞株HepG2購自美國ATCC公司;增殖缺陷型腺病毒Ad-p53購自深圳賽百諾公司。

  1.2  增殖性腺病毒載體 CNHK600-p53構建  設計引物,上游引物:5′-CCG GAA TTC GCC ATG GAG GAG CCG CAG T-3′;下游引物:5′-CGC GGA TCC TTA TCA GTC TGA GTC AGG CCC TTC TG-3′,PCR方法擴增p53基因,用膠回收試劑盒回收大小為1179 bp的DNA片段,回收片段及pUC19載體分別用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切,將酶切后的p53目的基因片段與酶切后的pUC19載體連接,連接產物轉化DH5α大腸桿菌感受態,挑取生長的細菌單克隆, PCR法篩選陽性克隆。抽提陽性克隆的質粒DNA,酶切鑒定并測序(TaKaRa)正確后命名為pUC19-p53,將pUC19-p53用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切,pClon17載體用EcoRⅠ和NheⅠ酶切,將酶切后p53目的基因片段與酶切后的pClon17載體連接,轉化DH5α大腸桿菌感受態,挑取生長的細菌單克隆,PCR法篩選陽性克隆。抽提陽性克隆的質粒DNA,PCR及酶切鑒定,鑒定正確后命名為pClon17-p53,將pClon17-p53用AgeⅠ、NotⅠ和ScaⅠ酶切,CNHK600用AgeⅠ、NotⅠ酶切,37℃水浴4h,分別電泳切膠回收2.469 kb和10.35 kb的片段,將酶切后含CMV啟動子+p53基因+SV40 poly-A加尾信號的目的片段與酶切后的CNHK600載體連接,轉化、挑克隆、抽提質粒,PCR及酶切鑒定。

  1.3  增殖性腺病毒CNHK600-p53的包裝及鑒定  利用Lipofectamine2000試劑盒,將質粒CNHK600-p53與和5型腺病毒骨架載體ppE3共轉染至293細胞。轉染后9~14天細胞出現病毒空斑,經過3次病毒空斑純化,應用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取腺病毒DNA(其具體方法參見QIAGEN公司操作說明)。一組引物(見構建部分)檢測p53基因的存在,另一組引物 (上游引物:5′-CTG GCC AAT ACC AAC CTT A-3′;下游引物:5′-ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC-3′)用來排除野生型腺病毒的存在。對病毒重組體進行PCR鑒定正確者命名為CNHK600-p53,即攜帶p53基因的雙調控增殖型腺病毒,氯化銫密度梯度離心法純化病毒,TCID50方法測得病毒滴度1.99×1010pfu/ml,-80℃保存。

  1.4  兩種病毒對肝癌細胞株增殖的影響  實驗分兩組:(1)單用CNHK600-p53組;(2)單用Ad-p53組。取對數生長期的肝癌細胞株(BEL-7402、QGY-7703、PLC/PRF5、HepG2)接種于3板96孔細胞培養板(約1×104個細胞/孔),培養24h,待細胞貼壁生長良好后吸去培養基。CNHK600-p53組及Ad-p53組分別加入病毒100μl/孔(對于肝癌細胞株QGY-7703和HepG2,MOI分別為0.01、0.1、1、10、100、1000;對于肝癌細胞株BEL-7402,MOI為0.001、0.01、0.1、1、10、100;對于肝癌細胞株PLC/PRF5,MOI為0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10;);加入病毒100μl/孔,每個濃度設4個復孔,置于5% CO2培養箱培養72 h,棄去培養液,加入無血清培養液100μl/孔,加MTT 10μl/孔,輕拍96孔板邊緣5min,置于37℃ 5%CO2孵箱內4~6 h;加10%SDS+0.01 mol/L HCl 100 μl/孔,輕拍96孔板邊緣5 min,置于37℃ 5%CO2孵箱內,過夜;酶聯免疫檢測儀, 測定570nm波長光密度值。以上實驗均重復3 次。

  1.5  統計學方法  數據以x±s表示,細胞抑制率=(對照孔D值-實驗孔D值)/對照孔D值×100%,統計分析采用率的U檢驗分析。

  2  結果

  單用CNHK600-p53組及單用Ad-p53組的細胞的D值及細胞抑制率詳見表1~4。

  表1  CNHK600-p53或Ad-p53對PLC/PRF5細胞的D值和細胞抑制率(略)

  表2  CNHK600-p53或Ad-p53對HepaG2細胞的D值和細胞抑制率(略)

  表3  CNHK600-p53或Ad-p53對BEL-7402細胞的D值和細胞抑制率(略)

  表4  CNHK600-p53或Ad-p53對QGY-7703細胞的D值和細胞抑制率(略)

  注:*P<0.05,**P<0.01 vs Ad-p53 group   

  隨著病毒MOI值的不斷增高其殺傷肝癌細胞能力也增強;單用CNHK600-p53組較單用Ad-p53組細胞抑制率高;但當細胞抑制率達到80%以上時,兩組之間差異無顯著性。

  3  討論

  1996年美國ONYX藥物公司研究的E1B55KD缺陷的增殖型腺病毒(ONYX-015),它利用腫瘤細胞中p53基因突變而正常細胞中p53正常的差異使病毒在腫瘤細胞中特異性增殖。目前該病毒已進入Ⅲ期臨床試驗。但是,單用該病毒療效甚微,有效率低于20%,所以必須與放化療聯合應用才能有效的殺傷腫瘤[2]。但ONYX-015存在著諸多不足,如在體內半衰期短,需要反復注射等。為此我們設想應用上面介紹的腫瘤特異性增殖型腺病毒攜帶某種對腫瘤治療有明確療效的抗癌基因,利用這類病毒在腫瘤細胞內特異性增殖及復制,而在正常細胞內不增殖的特點,從而使包括p53在內的抗癌基因在腫瘤細胞內特異性高效表達,這種結合病毒治療與基因治療優點的新型治療方案稱為基因病毒治療法。在前期的研究中,我們實驗室構建了腫瘤特異性增殖腺病毒CNHK500,體內及體外實驗結果均表明CNHK500在選擇性增殖和抗腫瘤療效上明顯優于ONYX-015,且在靜脈大劑量用藥的情況下未觀測到明顯的肝細胞毒性[3,4]。為了進一步降低病毒對正常細胞的毒性作用,提高安全性,我們利用正常細胞和腫瘤細胞的另一大差異—Rb基因,在CNHK500的基礎上構建了CNHK600。最近國外研究發現導入野生型p53基因聯合化療或放療,可取得較好的治療效果[5];p53基因的缺失或突變在腫瘤是非常常見的基因異常,p53基因突變影響腫瘤細胞對化療和放療的敏感性[6]。Ad-p53(商品名今又生)2004年在中國上市,是一種重組人p53基因的非增殖型腺病毒,該病毒對肺癌、皮膚癌、宮頸癌、胃癌、腸癌、食管癌、頭頸部癌等腫瘤患者的治療顯示,32%的患者腫瘤完全消失,27%的患者腫瘤部分消失,41%的患者腫瘤停止生長,顯示出良好的治療效果。但與其他的腫瘤基因治療一樣,Ad-p53也存在轉染率不高、表達不穩定、靶向性不強等問題。本實驗將p53基因插入增殖型腺病毒CNHK600,構建攜帶p53基因的增殖性腺病毒CNHK600-p53,該病毒缺失E1A中與Rb蛋白結合的基因序列,保留使腺病毒有效逃避宿主免疫監視及有效裂解宿主細胞而釋放子代病毒的E3區,用人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子及缺氧反應(HRE)啟動子來分別調控腺病毒的E1A及E1B基因,從而使病毒的復制更準確地靶向腫瘤細胞,力圖達到廣譜、特異、安全、高效的抗癌效果。通過體外實驗觀察CNHK600-p53是否優于Ad-p53,我們發現CNHK600-p53對肝癌細胞的抑制效果優于Ad-p53,但當細胞抑制率達到80%以上時,兩組之間差異無顯著性。原因可能為CNHK600-p53為增殖型腺病毒,其在腫瘤細胞內可以特異性的增殖,p53基因的表達量成倍數級增長,同時釋放出的病毒顆粒亦可殺傷腫瘤細胞;但當細胞抑制率達到80%以上時,肝癌細胞大部分死亡,影響了CNHK600-p53在肝癌細胞中的增殖有關。

  【參考文獻】

  1  Chan KT, Luang ML. Mutant p53 expression enhances drug resistance in a hepatocellular carcinoma cell line. Cancer Chemother Pharmacol, 2004, 53: 519-526.

  2  Chiocca EA, Abbed KM, Tatter S, et al. A phase I open-label, dose-escalation, multi-institutional trial of injection with an E1B-attenuated adenovirus, ONYX-015, into the peritumoral region of recurrent malignant gliomas in the adjuvant setting. Mol Ther, 2004,  10: 958-966.

  3  李月敏,宋三泰,江澤飛,等. 選擇性增殖腺病毒CNHK500治療腺癌的實驗研究. 中國腫瘤生物治療雜志,2005,12:124-128.

  4  張琪,彭林輝,吳紅平,等. 雙重調控選擇增殖型腺病毒CNHK500的構建及初步研究. 中華實驗外科雜志,2004,21:1366-1368.

  5  El-Aneed A. Current strategies in cancer gene therapy. Europ Pharmacol, 2004, 498: 1-8.

  6  Ferreira CG, Epping M, Kruyt FA, et al. Apoptosis: target of cancer therapy. Clin Cancer Res, 2002, 8: 2024-2034.
  
  (編輯:悅  銘)

  作者單位: 200438 上海,第二軍醫大學東方肝膽外科醫院綜合三科(△病毒基因治療實驗室)   


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