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乳腺癌患者RASSF1A基因啟動子區甲基化及臨床意義

來源:中華醫學研究雜志 作者:吳麗明,楊建平,王子慧,陳耀麗,李戈怡,莫先啟,黃 2006-12-18

摘要: 乳腺癌患者RASSF1A基因啟動子區甲基化及臨床意義(pdf) 【摘要】 目的 探討乳腺癌組織中RASSF1A(RAS association domain family 1A)基因啟動子區CPG島甲基化狀態及臨床意義。方法 用甲基化特異性PCR(MSP)檢測40份乳腺癌組織和24份正常乳腺組織中RASSF1A基因啟動子區甲基化狀態。結果 乳腺癌組織中RASSF1A基因啟動子......


  乳腺癌患者RASSF1A基因啟動子區甲基化及臨床意義(pdf)

    【摘要】  目的  探討乳腺癌組織中RASSF1A(RAS association domain family 1A)基因啟動子區CPG島甲基化狀態及臨床意義。方法  用甲基化特異性PCR(MSP)檢測40份乳腺癌組織和24份正常乳腺組織中RASSF1A基因啟動子區甲基化狀態。結果  乳腺癌組織中RASSF1A基因啟動子區CPG島甲基化率為45.0%(18/40),與正常乳腺組織比較差異有顯著性(2/24)(P<0.05),但與腫瘤病理類型、患者年齡、有無淋巴結轉移的差異無顯著性(P>0.05)。結論  RASSF1A基因啟動子區在乳腺癌中發生異常甲基化,為乳腺癌的候選基因。

  【關鍵詞】  乳腺癌; RASSF1A基因;基因甲基化;甲基化特異性PCR    

  Promoter methylation of RASSF1A gene in breast cancer patients and  its clinical significance

  WU  Li-ming, YANG Jian-ping, WANG  Zi-hui,et al.

  Department  of  Toxicology ,  Shenzhen  Center  for  Disease  Prevention  and  Control, Shenzhen  518020,   China
  【Abstract】  Objective  To investigate the methylation status of the CPG islands  in the promoter regions of RASSF1A  gene and to analyze its clinical significance in breast cancer patients.Methods  Methylation status of RASSF1A promoter was detected  by MSP in 40 cases of breast cancer tissues and 24 cases of matched benign tissues. Results  The frequency of promoter methylation of RASSF1A gene in tumor tissues was 45.0%(18/40),which was significantly higher than in benign tissues(8.3%,2/24)(P<0.05).But no significant association of abnormal methylation was identified with histological type ,the  patient’s age ,clinical features such as lymph node metastasis. Conclusion  Our findings showed that  there was hypermethylation of CPG islands in the promoter area of RASSF1A in breast cancer .So RASSF1A gene may be one of the new candidates of tumour suppressor  genes.

  【Key words】  breast  cancer; RASS domain family 1A gene;gene methylation; methylation  special  PCR (MSP)   

  RASSF1A是RAS相關結構域家族基因1(RAS associated domain family gene)的A轉錄產物,是一種與腫瘤相關的基因,該基因定位于染色體3p21.3區段,編碼一組RAS效應蛋白[1],已有報道顯示RASSF1A基因在正常組織中廣泛表達,但在肺癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中卻出現表達缺失[2]。因此認為RASSF1A基因的失活可能與腫瘤的發生有關。乳腺癌是由乳腺導管上皮發生的惡性腫瘤,是婦女的常見惡性腫瘤之一,在我國,乳腺癌占女性惡性腫瘤的前二位。乳腺癌的發生機制尚不清楚,尚沒有良好的治療方法,有關人體乳腺癌組織中的甲基化狀態與臨床病理的關系較少見報道。隨著表遺傳學研究的發展,發現抑癌基因啟動子區的甲基化是抑癌基因失活的主要機制之一。我們應用甲基化特異性PCR(MSP)檢測乳腺癌組織RASSF1A基因啟動子CPG島甲基化狀態,分析其與臨床的關系,以期進一步探討乳腺癌的發生機制并尋找乳腺癌治療的新方法。

  1  材料與方法

  1.1  標本來源  乳腺癌標本40份(乳腺浸潤性導管癌 34份,乳腺浸潤性小葉癌2份,導管內癌2份,小葉原位癌2份),年齡24~71歲;對照標本為距腫瘤邊緣2cm外正常組織24份,年齡25~68歲,標本均來自深圳北大醫院病理科2005年1~11月保存的蠟塊標本。經40g/L多聚甲醛固定,常規石蠟包埋,HE染色確診。患者術前未行放射治療或化學藥物治療。所有病例均經組織病理學檢查確診。

  1.2  試劑與儀器  亞硫酸氫鈉、氫醌Sigma公司, DNAzol Reagent、hotstartaq DNA酶Invitrogen公司, Wizard DNA clean-up system Promega公司,PCR擴增儀9700美國ABI公司。

  1.3  方法  將組織塊切成10μm薄片,每份取4~5片放入1.5ml離心管中,加1ml二甲苯,振蕩混勻,溶解并盡可能除去石蠟。加1ml無水乙醇,離心去上清。加1ml 75%乙醇漂洗1次[3]。每管加1ml DNAzol Reagent,按試劑盒操作抽提DNA。取1~2μg溶于20μl水,加入2.4 μl 3mmol/L NaOH,42℃ 20min,加入新鮮配制的208μl的10mol/L亞硫酸氫鈉(pH 5.0)和10mmol/L氫醌12μl混合后,55℃ 16h,取出后,以Wizard DNA clean-up system回收并純化后,將修飾的DNA置于溶于20μl水[4]。檢測RASSF1A啟動子甲基化狀態,甲基化擴增引物(M):F 5′-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3′,   R 5′-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3′, 擴增產物長度為94bp;非甲基化擴增引物(U):F  5′-TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG-3′,R  5′-CAAACCCCACAAACTAAAAACA-3′, 擴增產物長度為108 bp[5]:引物由上海生工生物公司合成。PCR反應體為25μl,包括磺化修飾后的DNA 2μl,10×buffer 2.5μl, 2.5mmol/L dNTP 2μl, hotstartaq酶1U,上下游引物各0.8μl,去離子水補齊至25μl,PCR反應條件:95℃變性15min,94℃ 30s,54℃ 40s,72℃ 30s,40個循環,72℃延伸10min,PCR產物置4℃待電泳檢測,PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳,Goldview染色后,紫外燈下觀察結果。        

  1.4  統計學分析  用SPSS10.0統計軟件進行統計分析,檢測數據用χ2檢驗

  2  結果 

  2.1  甲基化特異性PCR結果  乳腺癌組織提取的DNA分別擴增RASSF1A甲基化和非甲基化PCR產物,結果見圖1。40份乳腺癌組織標本中18份RASSF1A有甲基化引物擴增出特異PCR條帶,其中15份為部分甲基化,3份為完全甲基化。乳腺癌RASSF1A甲基化頻率為45.0%。24份正常乳腺組織中22份無甲基化引物擴增出特異PCR條帶,僅非甲基化引物擴增出特異PCR條帶。2份有甲基化引物擴增出特異PCR條帶。乳腺癌RASSF1A甲基化頻率與正常乳腺組織的比較差異有統計學意義(P<0.05)。

  U:非甲基化引物; M: 甲基化引物;Marker:DNA marker;T:乳腺癌組織;N: 正常乳腺組織;N1、N2、N3:正常乳腺組織非甲基化引物擴增出特異PCR條帶;T1、T5: 乳腺癌組織非甲基化引物擴增出特異PCR條帶;T2、T3:乳腺癌組織完全甲基化,僅甲基化引物都擴增出特異PCR條帶;T4:乳腺癌組織部分甲基化,即甲基化與非甲基化引物都擴增出特異PCR條帶

  圖1  RASSF1A啟動子甲基化電泳圖(略)

  2.2  乳腺癌RASSF1A甲基化與臨床特征的關系  見表1。40份乳腺癌組織中,RASSF1A基因甲基化率在浸潤性導管癌中為15/34(44.2%),在浸潤性小葉癌、導管內癌、小葉原位癌中為1/2(50%),差異無顯著性(P>0.05)。提示RASSF1A基因甲基化與乳腺癌病理組織學分型未見明顯相關。乳腺癌 RASSF1A基因甲基化率在發病年齡20~35歲為50.0%,36~50歲為33.3%,>50歲為50.0%,三者差異無顯著性(P>0.05)。提示RASSF1A基因甲基化與乳腺癌發病年齡未能見明顯相關。乳腺癌發生淋巴結轉移的 RASSF1A基因甲基化率為42.9%,乳腺癌沒發生淋巴結轉移的 RASSF1A基因甲基化率為45.5%,兩者差異無顯著性(P>0.05)。

  表1  RASSF1A基因甲基化與臨床病理的關系(略)

  注:P>0.05

  3  討論  

  近年來分子生物學技術的發展,明顯改變了人們對腫瘤發生機制的認識,控制基因表達而沒有影響基因序列的表遺傳機制越來越受到重視。DNA甲基化是表遺傳修飾機制之一。腫瘤中基因組甲基化改變常見二種方式:DNA廣泛性低甲基化導致染色體不穩定性,從而引起基因突變。另一方面,抑癌基因啟動子區CpG島高甲基化異常,引起基因表達沉默,細胞異常增殖導致惡化。且DNA甲基化造成的基因異常對腫瘤的發生及發展有著重要影響[6,7]。而且甲基化機制可能在腫瘤的發病機制上是早期事件,所以利用此機制進行腫瘤的臨床診斷具有重要意義。

 
  目前基因甲基化研究方法很多,如限制性內切酶法、基因測序法、Southern印跡法、變性高效液相色譜法、甲基化特異性PCR(MSP)等。MSP方法簡便、快速、靈敏性高,對DNA的質和量要求低,能用于微量的DNA或石蠟包埋組織DNA的甲基化分析。                        

  已有研究表明,人類腫瘤組織和腫瘤細胞株RASSF1A基因存在高頻率的啟動子區CpG島高甲基化,多數腫瘤組織的RASSF1A基因啟動子甲基化的發生率在35%~60%,非小細胞肺癌(38%)[1]、鼻咽癌(66.7%)[5]、肝外膽管癌(42.5%)[8]、膠質瘤(39.3%)[9]、賁門癌(64%)[10]等有較高的發生率。非癌組織的RASSF1A基因未見或僅見極低頻率的甲基化。本研究發現乳腺癌患者腫瘤組織中RASSF1A基因啟動子甲基化的發生率高達45%,而相應癌旁組織僅為8.3%,與上述文獻結果一致,且乳腺癌RASSF1A甲基化頻率與腫瘤病理組織學分型、有無淋巴結轉移、患者發病年齡未能見明顯相關。提示RASSF1A基因甲基化是乳腺癌發生過程中早期事件,并確立RASSF1A基因為乳腺癌的候選基因。本文采用MSP方法檢測乳腺癌組織中RASSF1A基因甲基化的成功,為乳腺癌的回顧性研究及大范圍的病因學普查提供了可靠的實驗方法。

  【參考文獻】

  1  Dammann R, Li C, Yoon JH, et al. Epigenetic inactivation of  a RAS association domain  family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3.Nat Genet,2000,25:315-319.

  2  Kazmin I,Liu L,Dammann R,et al.Inactivation of RAS association domain family 1A  gene in cervical carcinomas and the role of  humam papillomovirus infection. Cancer  Res ,2003,63:1888-1893.

  3  黨艷麗,鄭維國,辛曉燕.宮頸癌細胞中DAPK1基因CPG島甲基化及其表達.第四軍醫大學學報,2004,25:1126-1128.

  4  Herman JG,Graff JR,Myohanen S, et al. Methylation-specific PCR:A novel PCR assay  for methylation status of CpG islands.Proc Natl Sci  USA,1996,93:9821-9826.

  5  Lo KW,Kwong J,Hui AB,et al.High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in  nasopharyngeal  carcinoma.Cancer Res,2001,61:3877-3881.

  6  Ribieras S,Song-Wang XG,Martin V,et al. Human breast and colon cancers  exhibit  alterations of  DNA  methylation  patterns  at  several  DNA  segments on  chromosomes 11p and  17p.J Cell Biochem,1994,56:86-96.

  7  Pfeifer GP,Tang M,Denissenko MF. Mutation hotspots and  DNA methylation. Cur Top Microbiol Immunol,2000,249:1-19.

  8  陳勇軍,唐啟彬,鄒聲泉.散發性肝外膽管癌中RASSF1A基因啟動子甲基化狀態的研究.中華實驗外科雜志,2004,21(12):1430-1432.

  9  高云霞,關明,張方忠,等.膠質瘤患者RASSF1A基因轉錄表達和啟動子區甲基化的研究.中華檢驗醫學雜志,2004,27(7):427-430.

  10  易會興,王立東,何欣.賁門癌組織RASSF1A基因啟動子甲基化測定.鄭州大學學報(醫學版),2006,41(1):17-19.

  (編輯:秋  實)

  基金項目:深圳市科技局基金項目(NoJH200507131076A)

  作者單位: 518020 廣東深圳,深圳市疾病預防控制中心毒理科    

        518036 廣東深圳, 深圳北大醫院病理科   


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