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端粒、端粒酶與癌癥

來源:中華醫學研究雜志 作者:張友亭,郭曉農 2006-12-18

摘要: 端粒、端粒酶與癌癥(pdf) 【摘要】 端粒和端粒酶是近年來生命科學研究的熱點。細胞分裂過程中,因其染色體末端(端粒)DNA不能完全復制而縮短,使細胞逐漸失去增殖能力而衰老,端粒酶可延長染色體末端DNA,端粒酶的活化使細胞獲得無限增殖能力。在永生細胞系及絕大多數的惡性腫瘤(85% ) 細胞中有活化的端粒酶。本文綜述了端......


  端粒、端粒酶與癌癥(pdf)

    【摘要】  端粒和端粒酶是近年來生命科學研究的熱點。細胞分裂過程中,因其染色體末端(端粒)DNA不能完全復制而縮短,使細胞逐漸失去增殖能力而衰老,端粒酶可延長染色體末端DNA,端粒酶的活化使細胞獲得無限增殖能力。在永生細胞系及絕大多數的惡性腫瘤(85% ) 細胞中有活化的端粒酶。本文綜述了端粒與端粒酶的結構與功能,端粒酶在端粒合成與穩定中的作用,介紹了端粒酶活性的測定方法,并討論了通過抑制端粒酶活性來治療癌癥的可能性。
   
  【關鍵詞】  端粒;端粒酶;癌癥
 
  端粒(telomere) 和端粒酶(telom erase) 是近年來生命科學研究的熱點之一,正常細胞在分裂過程中,因其染色體末端(端粒)DNA 不能完全復制而縮短,細胞經多次分裂后,端粒縮短達到危機點(crisis),促發某一信號,使細胞逐漸失去增殖能力而衰老死亡。端粒酶可延長染色體末端DNA,端粒酶的活化使細胞獲得無限增殖能力。基于此,有少數細胞(如永生細胞系) 及絕大多數惡性腫瘤細胞(85%) 可逃逸這一危機點。因為在這些細胞中含有活化的端粒酶系統,從而使細胞獲得無限增殖能力,使之永生化和惡變,因此,對端粒和端粒酶系統的研究,有助于闡明細胞衰老和惡變機制,對腫瘤的診斷、治療以及抗衰老都具有重要的理論和實際意義。一般認為,癌癥是由多種突變的積累,破壞了細胞正常的生長調控而引起的,除了一些明確的病因外,有許多實驗結果支持這樣一種假說,即端粒酶的激活對許多惡性腫瘤細胞的形成是必需的,且腫瘤細胞與端粒酶活動增加之間存在相互激發的關系[1]。這種顯著的相關性提示: 在腫瘤細胞惡性狀態的進展和維持中,端粒酶可能起到關鍵性的作用。本文就端粒與端粒酶研究的最新進展作一綜述,具體討論了端粒的結構與功能,端粒酶在端粒合成與穩定中的作用,介紹了端粒酶活性的測定方法,細胞永生與端粒酶激活的關系,提出了通過抑制端粒酶活性來治療癌癥的可能性。

  1  端粒(telomere)

  1.1  端粒(telomere) 的概念 

  端粒是指真核細胞線性染色體末端的蛋白質-DNA特殊結構,即染色體末端DNA 序列的多個重復,其作用是保護和穩定染色體的末端,它由2~20kb 串聯的短片段重復序列(TTAGGG) n 及一些結合蛋白組成。四膜蟲(單細胞生物) 端粒的結構是6 個核苷酸5′- TTGGGG - 3′序列的多次重復。人類為5′-TTAGGG- 3′序列的多次重復。隨著細胞不斷分裂,染色體復制次數增加,端粒DNA 序列進行性縮短。故粒端長度決定了細胞壽命,至一定長度時,細胞停止分化,并出現程序性死亡(細胞凋亡,Apoptosis) 。端粒作為細胞的“有絲分裂鐘”(mitosis clock) 調節細胞分裂。早衰的端粒長度明顯低于正常人,而人精原細胞的端粒長度比體細胞長數千kb,并不隨年齡增長而遞減[2]。
 
  1.2  端粒的結構、功能 

  1978年,Blackbum發現一種單細胞池塘生物四膜蟲的染色體端粒DNA 為一種簡單核苷酸序列的大量重復,即(TTGGGG)n,后來證明人和脊椎動物的端粒均為含有豐富鳥嘌呤(G) 的重復DNA 序列,人類端粒DNA 由5′TTAGGG3′的重復單位構成,細胞中端粒DNA 總是和非組蛋白成分的蛋白質結合成一個復合體,其結構雖不清楚,但它有重要的作用,可以保護染色體末端不被核酸酶降解,防止染色體末端丟失、融合,并參與染色體在核內定位及基因表達調控的作用,從而保持遺傳系統的穩定性。

  2  端粒酶

  2.1  端粒酶的概念 

  端粒酶為一種RNA 依賴性DNA 聚合酶,為一種核糖核蛋白酶,是合成端粒必需的酶。端粒的合成是以一段RNA為模板,端粒酶通過反轉錄過程合成端粒片段,并使其連接于染色體的端粒末端。端粒酶的發現,解釋了生物細胞“末端復制問題”,并將兩個看似不相關的研究領域—衰老和癌癥緊密地聯系在一起。Kim等(1994) 建立了能穩定、成批、快速分析各組織端粒酶活性的Trap 法,這是Kim 等巧妙引用了PCR 技術形成的粒端重復擴增分析法。端粒酶活性的調節所知甚少,調節細胞凋亡的存活因子Bcl-2可能對端粒酶的激活有正相調節功能。

  2.2  端粒酶結構、功能 

  端粒酶是一種依賴于RNA的DNA聚合酶,目前認為它由三部分組成:端粒酶RNA組分、端粒酶相關蛋白、端粒酶催化亞基。人類端粒酶基因定位在5P15·33,其編碼了1132 個氨基酸的多肽,它是以RNA 為模板的逆轉錄酶,通過識別端粒單鏈的富G區引物,合成多個端粒重復序列到3′端,所以端粒酶有端粒再生的作用。人類胚胎發育的早期,很多組織可檢測到端粒酶活性,但隨著人類組織和細胞的分化,端粒酶活性迅速降低,到成人,僅有包括生殖細胞在內的少數細胞或細胞系仍具端粒酶活性,大多體細胞已檢測不到。

  3  端粒酶活性的測定方法

  最初采用的標準檢測端粒酶的方法是:分析細胞提取液在引物3′ 2末端上合成重復序列的能力,通過放射性核苷酸標記、聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影的觀察,結果端粒酶酶促反應呈現出6 個核苷酸合成的脈沖性,因而形成典型的間隔6 個核苷酸的端粒酶條帶模式圖譜。盡管用這種方法檢測原代腫瘤樣本中的端粒酶較為困難,但還是有兩個研究小組設法用該項技術證實了卵巢上皮癌與惡性造血細胞癌的提取物中有活化的端粒酶[3]。此外,亦有人用放射性標記的特異性探針進行原位雜交,通過檢測組織細胞中RNA 表達水平來反映端粒酶的有無[4]。人類細胞中正常的46 條染色體,即有92個端粒。通過檢測不同組織類型細胞中染色體端粒的平均長度,可以間接地檢測端粒酶。端粒DNA 長度的測定,一般采用染色體末端限制片段分析法,以(TTA GGG) 4 為探針的Southern 雜交進行分析,該法的缺陷在于永生細胞中端粒長度并不能真正反映端粒酶的活性。目前,測定端粒酶活性主要采用Kim 等建立的端粒重復序列擴增法。該法采用了兩項革新技術,極大地提高了端粒酶分析的敏感性(提高了104倍)。首先是對抽提物的準備和預處理,使用去污劑裂解細胞,從少量的細胞中提取有效的端粒酶(舊法采用的是低滲裂解);最主要的突破是允許一個端粒酶反應的產物以倍增指數方式進行擴增。這種擴增是通過應用一個端粒酶催化的引物,延伸反應產物作模板進行PCR,通過連續的以寡聚核苷酸為引物的DNA 合成,擴增產物進行電泳,以此來反映端粒酶的活性。該法涉及到的兩對引物是: 正向引物為5′ 2AA TCCGTCGA GCA GA GTT2 3′和反向引物為5′ 2 ( CCCTTA ) 3 CCCTAA 2 3′。本法具有敏感、快速、高效的特點,但易受各種外來因素的干擾和同位素污染。最近Iwama 等對TRA P 法又進行了改進,采用內部端粒酶測定標準的熒光端粒重復擴增法,可克服此點之不足,且可進行半定量分析,是檢測端粒酶活性較為理想的方法。

  4  端粒酶與腫瘤診斷和治療

  由于端粒酶活性見于絕大多數惡性腫瘤,而人正常體細胞中未見該酶活性,端粒酶活性為惡性腫瘤的診斷和治療帶來了希望。首先,端粒酶活性的檢測有希望成為早期惡性腫瘤診斷和判斷腫瘤預后的標志物。例如端粒酶活性的檢測可作為篩選早期惡性腫瘤的標志物,若能將轉移癌細胞與外周血細胞分開亦可作為早期轉移癌的標志物。大約20%~30%乳腺癌不伴有腋窩淋巴結轉移的病例未見有端粒酶活性,同時伴有腋窩淋巴結轉移的乳腺癌病例其端粒酶活性的檢出率超過95%,表明端粒酶可作為獨立的判斷乳腺癌預后及復發的指標[5]。術前對組織進行端粒酶分析可給外科醫生提供更多的信息,敏感的端粒酶分析法可用于細針穿刺組織使得術前判斷病人預后成為可能。其次,由于端粒酶活性是保持絕大多數惡性腫瘤細胞繼續生長必須之酶,抗癌藥物建立在抑制端粒酶活性的基礎上可能會得到高效治療效果和最低的副作用。端粒酶在生殖細胞和其它永久存活細胞內的功能是保持端粒長度,使細胞能不斷地分裂。目前看來該酶是治療癌癥比較特異和明確的目標[6~9]。雖然要考慮到抑制腫瘤細胞端粒酶活性的同時也抑制了生殖細胞和造血干細胞端粒酶活性,但是此治療設想比現用治療的毒性和副作用低,通常的化療除了對干細胞有作用外,對所有增生的細胞均起作用。用端粒酶抑制劑會減輕或避免常規化療所引起的惡心、脫發等副作用。應該考慮到端粒酶抑制劑一定在端粒縮短到一定程度端粒酶被激活后,才能發揮效應,所以可能需要一段時間。設計用該酶抑制劑治療腫瘤首先應設法加快腫瘤細胞端粒的縮短速度,以盡快使抑制劑發揮作用達到治療腫瘤的目的。

  5  端粒酶的基因研究初步概況

  編碼端粒酶全酶的整個基因仍未被人們所認識。但目前認為,端粒酶為RNA 依賴性DNA 聚合酶,端粒酶的亞單位工作是以RNA 為模板合成端粒DNA 片段。在許多生物中包括人類編碼端粒酶的這段RNA 模板基因已被克隆。除此之外,還確定了與激活端粒酶有關的3種相關蛋白:P80、P95 和TP1。P80和P95蛋白已從纖毛四膜蟲中純化。編碼與P80 相似的哺乳動物的TP1 蛋白的基因已克隆成功。迄今為止這些蛋白在端粒酶中所起的確切功能尚不得而知 。哺乳動物TP1 蛋白與四膜蟲P80蛋白的氨基酸順序極為相似。TP1 蛋白表現出與哺乳動物端粒酶RNA 的特異性結合。TP1 的抗血清與有端粒酶活性的細胞提取液顯免疫沉淀反應,提示TP1 在體內與端粒酶密切相關。

  綜上所述,近幾年,端粒及端粒酶的研究引起分子生物學家的濃厚興趣,在酶的三維結構預測、基因的克隆、種系的發生,都取得一定進展[10~12]。在對影響端粒長度的各種分子之間相互作用機制闡清的基礎上,相信端粒及端粒酶的研究必將在延長細胞壽命、腫瘤檢測與診治、基因治療等方面取得廣泛的應用前景。
 
  【參考文獻】

  1  鄭偉,石一復,王升啟,等.端粒酶RNA和端粒酶活性在人生殖道癌細胞株中的表達.細胞生物學雜志,1998,20:25.

  2  楊澤.衰老與長壽的遺傳機制探討.國外醫學·遺傳學分冊,2002,23(4):2111.

  3  鄧銘.端粒、端粒酶和腫瘤發生的關系.國外醫學·遺傳學分冊,2002,23(4):2171.

  4  胡云清.端粒、隱性嵌合體、雜合性丟失與多基因病.國外醫學·遺傳學分冊,2000,23(1):48.

  5  胡桂英.端粒、端粒酶與婦科腫瘤.國外醫學·遺傳學分冊,2000,23(6):300.

  6  王偉.端粒、端粒酶及其生物學功能的研究進展.山西大學學報(自然科學版),1998,21 (4):389-393.

  7  劉鴻禧.端粒、端粒酶活性的研究與癌癥.汕頭大學醫學院學報,1997,10(增刊):100.
 
  8  黃志勇.端粒、端粒酶與癌癥.中國醫師雜志,2001,3(11):809.

  9  阮曉峰.端粒、端粒酶與癌癥治療進展.臨床腫瘤學雜志,1999,4(2):73.

  10  胡建.端粒、端粒酶研究的最新進展.生命科學,2001,13(3):150.
 
  11  虞偉.端粒與端粒酶的研究進展.Bulletin of Jinling Hospital,1999,173.

  12  楊學輝,馮威健.端粒與端粒酶研究進展.生物化學與生物物理,1996,23(6):420.

  作者單位: 525100 廣東化州,化州市人民醫院藥劑科(Δ蘭州大學生命科學院生物化學與分子生物專業2003級碩士)


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