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我國布魯氏菌病病原學診斷方法研究概況

來源:中華醫學研究雜志 作者:李鐵鋒, 李軍 2006-12-18

摘要: 我國布魯氏菌病病原學診斷方法研究概況 (pdf) 布氏菌病是難以分離培養和鑒定的細菌,正確的病原學診斷,可為布氏菌病的防治工作和疫區分類提供可靠的依據。隨著科學技術的發展,經過多年的研究和探討,已建立了多種布氏菌病病原學診斷方法,并已達到分子診斷水平。 1 DNA G+C MOL%含量的測定及DNA同源性分析在布氏菌病病......


 我國布魯氏菌病病原學診斷方法研究概況 (pdf) 

    布氏菌病是難以分離培養和鑒定的細菌,正確的病原學診斷,可為布氏菌病的防治工作和疫區分類提供可靠的依據。隨著科學技術的發展,經過多年的研究和探討,已建立了多種布氏菌病病原學診斷方法,并已達到分子診斷水平。

    1  DNA G+C MOL%含量的測定及DNA同源性分析在布氏菌病病原學診斷中的應用

    郭秀蘭利用熱變形方法,對不同種布氏菌的DNA分子中G+C MOL%進行測定,證實布氏菌DNA分子中G+C含量非常相似(56.0%~58.0%)[1]。王曉英對傳統的熱變性溫度法測Tm值加以改進,測得值與文獻[1]相符[2]。

    〖H吳從雅以液相復性速率分子雜交法測23株布氏菌及大腸桿菌K12、綠膿桿菌、痢疾桿菌、耶爾森氏菌O:9、鼠傷寒桿菌等5株對照菌及5株可疑布氏菌的DNA與布氏菌DNA雜交率。證實布氏菌屬內細菌具有高度同源性[3]。而郭秀蘭對6種不同型布氏菌做了同源性測定,證明布氏菌6個種不同型間DNA同源率82.7%~104.2%,是高度同源的[4]。利用熱變性溫度法測定布氏菌G+C含量和DNA雜交技術測定其同源性,不受菌齡、外環境變化的影響,且穩定、可靠、重復性好。為鑒定非典型及變異布氏菌提供了科學可靠的方法[5]。

    2  布氏菌外膜蛋白的研究

    布氏菌外膜蛋白分3大類,第1組分子量為88~94KD,第2組分子量為35~40KD,第3組分子量為25~30KD。武素懷等用兩性離子去污劑從牛、羊、豬種布氏菌的光滑型、粗糙標準型、非典型株中提出了外膜蛋白。利用SDS-PAGE方法,對布氏菌外膜蛋白進行了研究,發現了布氏菌外膜蛋白的某些成分有非常相似的電泳帶類型。其中微孔蛋白的三聚體及解聚后所形成的單體存在形式不同,反映在SDS-PAGE圖譜上的帶形具有種的特異性[6],這為布氏菌種間鑒定提供了一種新手段[7]。卿燕等報道,用布氏菌外膜蛋白抗原,對142份急、慢性期布氏菌病患者血清做免疫酶斑點試驗。結果表明,敏感性、特異性和操作程序均優于ELISA,可供大量布氏菌病血清檢查用。同時所采用的外膜蛋白抗原為診斷粗糙型及非典型布氏菌引起的布氏菌病提供了廣譜抗原,用于布氏菌病的實驗室診斷[8]。

    3  布氏菌染色體DNA的酶切分析

    用核酸限制性內切酶處理細菌DNA,所得片段的電泳圖用以區別細菌的種,此法也被用于布氏菌的DNA分析[9]。唐瀏英對布氏菌1330S、16M、544A染色體DAN最適酶切條件進行了研究,探討了影響限制性內切酶對DNA消化的因素[10]。李元凱利用HindIII、BgII、EcoRI 3種酶對16M、544A和8株非典型布氏菌株的DNA片段進行消化,證明3種酶能將以上菌株切開,但非典型菌株之間、非典型菌株與標準菌株之間均未看出明顯差別[11]。用核酸限制性內切酶圖譜是不能區別布氏菌的種和型,或很難區別。

    4  單克隆抗體的制備及在布氏菌病病原學診斷中的應用

    魯齊發等應用雜交瘤技術獲得了兩種抗布氏菌表面抗原A和M的單克隆抗體15及58。這兩種抗體初步可對牛種與羊種布氏菌1型及其他一些生物型菌相鑒別[12]。同時還應用了犬種和綿羊附睪種布氏菌單克隆抗體對不同種型布氏菌株進行檢測,證明兩種單克隆抗體對粗糙型布氏菌有特異性,可用于粗糙型與光滑型布氏菌的鑒別,特別是采用ELISA對粗糙型布氏菌的確定,不僅可做定性或定量檢測,而且敏感性明顯高于凝集反應[13]。金根源等使用反向單克隆抗體酶聯免疫法檢測用布氏菌感染小鼠后1、3、6個月其臟器中抗原存在情況,同時分離細菌及作血清學檢查。結果表明,反向單克隆抗體酶聯免疫法檢測抗原陽性高,并有較強的特異性,此法不但可以提示受感染者的保菌情況,并且比細菌分離法敏感等優點[14]。

    5  布氏菌染色體基因庫的建立

    劉興漢等采用PBR328載體,經過幾輪工作后,建立了布氏菌強毒株M28染色體基因庫,并對質粒載體和噬菌體載體作了比較。一質粒為載體構件染色體基因庫,載體所能容納的外來片段較小,需要建立較大的基因庫,篩選工作繁重,同時外來DAN片段越小,切斷有用基因的風險也越大,而用此方法一旦篩選出陽性克隆,有可能直接發展為診斷試劑和基因工程菌苗。布氏菌基因庫的建立,為解決布氏菌病的診斷、治療和預防以及消滅布氏菌病奠定了基礎[15]。

    6  聚合酶鏈反應(PCR)在布氏菌病病原學診斷中的應用

    唐瀏英等把PCR用于布氏菌的檢測[16],所采用的引物序列是由編碼牛種布氏菌36kD外膜蛋白基因序列設計的,兩引物均為24bp,間隔180 bp。擴增了布氏菌牛、羊、豬、沙漠森林鼠、綿羊附睪、犬6個種的染色體DNA,均獲得陽性擴增結果。李鐵鋒等[17]采用編碼牛種布氏菌31KD外膜蛋白基因序列設計的,不同擴增片段的3對引物,對布氏菌DNA檢測進行了實驗研究。證明,通過此種方法可檢測到小到1PG的布氏菌DNA。對布氏菌5個種的典型株進行DNA分析,并獲得獨有的相應片段。而兩種與布氏菌SPP存在血清學交叉反應的革蘭陰性細菌未檢測到特異DNA片段。同時,王季秋等[18]采用上述3對引物對急、慢性期布氏菌病患者(50例)、健康人(45例)及感染布氏菌后的豚鼠全血進行檢測。結果,42例急慢性期布氏菌病患者和5例健康人PCR試驗為陽性,感染豚鼠全部陽性。PCR試驗診斷布氏菌病病人具有較高的敏感性和一定的特異性,其應用前景較好。

    【參考文獻】

    1  郭秀蘭.布魯氏菌DNA的提取及G+C mol%測定的研究.中國地方病防治雜志,1987,2(增刊):9.

    2  王曉英.細菌DNA G+C mol%在布魯氏菌種鑒定中的應用. 中國地方病防治雜志,1992,7(2):95.

    3  吳從雅.布魯氏菌DNA同源性研究報告.中華流行病學雜志,1989,10(特刊6):60.

    4  郭秀蘭.應用細菌DNA同源性鑒定布氏菌.中國畜禽傳染病,1990,5:9.

    5  李元凱.常規鑒定方法表現異常的布魯氏菌非典型株的鑒定研究.中國八十年代布魯氏菌病防治研究進展.北京:中國科學技術出版社,1991.

    6  伍素懷.布魯氏菌外膜蛋白的研究. 中國八十年代布魯氏菌病防治研究進展.北京:中國科學技術出版社,1991.

    7  尚德秋.布魯氏菌非典型菌株及R型菌株鑒定分類的研究. 中國八十年代布魯氏菌病防治研究進展.北京:中國科學技術出版社,1991.

    8  卿燕.用布魯氏菌外膜蛋白抗原的免疫酶斑點試驗檢測布病患者的抗體.全國布病學術會議材料,1990.

    9  薛平.用現行DNA數據命名布氏菌的建議.地方病譯叢,1987,6:15.

    10  唐瀏英.布氏菌1330S、 16M 、544A染色體最適酶切條件的選擇. 中國地方病防治雜志,1992,7(4):209.

    11  李元凱.布魯氏菌非典型菌株的分子生物學研究. 中國地方病防治雜志,1997,12(6-A):8.

    12  魯齊發.布魯氏菌非典型菌株的分子生物學研究.全國布病學術會議材料,1990.

    13  魯齊發.粗糙型布氏菌單克隆抗體的制備及應用于種型鑒定的實驗報告. 中國八十年代布魯氏菌病防治研究進展.北京:中國科學技術出版社,1991.

    14  金根源.反向單克隆抗體斑點酶聯免疫法檢測布魯氏菌病抗原的初步應用. 全國布病學術會議材料,1990.

    15  劉興漢.布魯氏強毒株M28染色體基因庫的構件. 中國八十年代布魯氏菌病防治研究進展.北京:中國科學技術出版社,1991.

    16  唐瀏英.應用分子生物學技術檢測布魯氏菌抗原的研究.中國地方病防治雜志,1995,10(4):199.

    17  李鐵鋒.PCR檢測布氏菌DNA的試驗研究. 中國地方病防治雜志,2002,17(4):211.

    18  王季秋.全血聚合酶鏈反應實驗在診斷布氏菌病中的應用效果觀察. 中國地方病防治雜志,2003,18(1):10.

    作者單位:137000 吉林白城,吉林省地方病第一防治研究所

  (編輯:悅  銘)


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