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重組CD200基因在COS-7細胞中的瞬時表達

來源:中華醫學研究雜志 作者:高嵩,郝兵,侯治富 2006-12-18

摘要: 重組CD200基因在COS-7細胞中的瞬時表達 (pdf) 【摘要】 目的 研究構建于重組真核表達載體pcDNA3-CD200上的CD200基因在COS-7細胞中的瞬時表達。方法 體外擴增并酶切鑒定pcDNA3-CD200質粒。常規方法培養COS-7細胞。用電轉染基因法將pcDNA3-CD200質粒轉入COS-7細胞中,用流式細胞術(FCM)檢測轉染細胞CD200表達。...


     重組CD200基因在COS-7細胞中的瞬時表達 (pdf) 

    【摘要】  目的  研究構建于重組真核表達載體pcDNA3-CD200上的CD200基因在COS-7細胞中的瞬時表達。方法  體外擴增并酶切鑒定pcDNA3-CD200質粒;常規方法培養COS-7細胞;用電轉染基因法將pcDNA3-CD200質粒轉入COS-7細胞中,用流式細胞術(FCM)檢測轉染細胞CD200表達。結果  轉染COS-7細胞后72h,CD200基因表達陽性的細胞計數率為44.5%。結論  成功的利用電轉染基因法將重組真核表達載體pcDNA3-CD200轉染到COS-7細胞中,并實現了在COS-7細胞中的瞬時表達,為進一步研究CD200的生物學活性以及信號傳導奠定了基礎。

    【關鍵詞】  CD200;COS-7細胞;  電轉染;  流式細胞術

     Transient expression of recombinant CD200 gene in COS-7 cells

    GAO Song,HAO Bing,HOU Zhi-fu,et al.  Department of Clinical Laboratory,Second Affiliated Hospital,Zhejiang University College of Medicine,Hangzhou 310009,China

    【Abstract】  Objective   The transient expression of CD200 gene which was constructed to the recombinant eukaryotic expression vector  pcDNA3-CD200 was tested. Methods  pcDNA3-CD200 plasmid was amplified and tested by an enzyme cutting technique. COS-7 cell was cultured in vitro and transferred with pcDNA3-CD200 by electrotransfer media method. The expression of CD200 was detected by flow cytometry. Results   After the COS-7 cell was transferred for 72 hours,the expressing rate was recorded for 44.5%. Conclusion   The recombinant eukaryotic expression vector  pcDNA3-CD200 was transferred into COS-7 cells successfully by electrotransfer media method. After being transferred to COS-7 cells, the CD200 protein was expressed, which lays a foundation for further studying biological activity and signal transduction of CD200.

    【Key words】  CD200;  COS-7 cells;  electro transfer;  flow cytometry

    CD200是Ⅰ型膜糖蛋白,為免疫球蛋白超家族的新成員,廣泛表達在人類胸腺細胞、B細胞、激活的T細胞、濾泡狀樹突細胞、神經元及血管內皮上[1]。近年來的研究發現,CD200和其受體(CD200R)的交互作用可以下調髓樣細胞的活性,從而減輕多種自身免疫性疾病癥狀、延長同種或異種移植物存活時間、抑制前炎癥因子引起的流產、誘導免疫耐受等[2~4]。為深入探討該基因的功能,本實驗應用電轉染技術,介導目的基因CD200轉染到COS-7細胞中,建立該基因的瞬時表達系統,為進一步在體外研究該分子對髓樣細胞的調控機制打下了實驗基礎。

    1  材料與方法

    1.1  質粒和細胞株  pcDNA3-CD200質粒由筆者構建[5] ;COS-7細胞株由吉林大學中日聯誼醫院中心實驗室常規培養。

    1.2  試劑及儀器  DMEM培養基購自Gibco公司;胎牛血清購自天津TBD公司; FITC標記的鼠抗人CD200單克隆抗體購自Santa Cruz公司;質粒提取試劑盒、限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ、DL2000 Marker和λDNA HindⅢ digest Marker均購自大連Takara公司,化學試劑均為國產  分析純。儀器:CO2培養箱系日本平澤公司生產;MT-2型倒置顯微鏡系日本Olympus公司生產;電轉染儀系Eppendorf公 司生產;流式細胞儀(ELITE-Ⅱ)系美國Coulter生 產。

    1.3  重組質粒的制備及酶切鑒定  質粒經擴增后,參照質粒提取試劑盒說明提取、純化質粒,經EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定,并用紫外分光光度計測定DNA含量和純度。

    1.4  電穿孔法轉染COS-7細胞  基因轉染設立pcDNA3-CD200重組質粒組、pcDNA3空質粒組及對照組,采用電穿孔方法轉染[6]。COS-7細胞用含10% FCS的DMEM培養于100ml的細胞培養瓶,約75%長滿,0.25% 胰酶加EDTA消化后離心收集細胞,用少量PBS液重懸,調整每組細胞數至1×106個/ml。分別取20μg的pcDNA3-CD200重組質粒、pcDNA3質粒加入相應的細胞懸液中混勻,各組均分別移入0.2cm 的電穿孔杯中,冰浴10min后放入電穿孔儀的正負極之間。電穿孔參數為:真核、使用脈沖的電壓110V,間隔時間20ms,電阻∞,穿孔1次。電擊后將穿孔杯繼續冰浴5min,移入已含10% FCS的DMEM完全培養液的24孔板,37℃ 5%CO2孵箱培養。

    1.5  流式細胞檢測轉染效果  72h后用PBS調整各組細胞數為1×106/ml,清洗2次后加入90μl PBS、10μl FITC標記的鼠抗人CD200抗體,充分混勻,避光4℃ 孵育30min后,每組用PBS重懸混勻離心棄上清,各加入500μl PBS,用30目濾網過濾,上機檢測CD200的表達。

    2  結果

    2.1  重組質粒的酶切鑒定  重組質粒pcDNA3-CD200(6210bp)用EcoRⅠ和HindⅢ做雙酶切,雙酶切后有2條帶,一條在5400bp,另一條在810bp處,810bp處的條帶與CD200 PCR條帶大小一致,見圖1。

    2.2  流式細胞術檢測CD200的表達  pcDNA3-CD200重組質粒組、pcDNA3空質粒組及對照組CD200的表達率分別為44.5 %、1.9 %及1.0 %(圖2 A、B、C)。

   3  討論

    1979年,McMaster 和Williams用Ia類似的糖蛋白免疫大白鼠后,發現胸腺中有一種過度表達的糖蛋白,命名為MRC OX2[7] ,在HLDA7(7th Workshop And Conference On Human Leukocyte Differentiation Antigens)會議上MRC OX2被正式命名為CD200。CD200分子包含2個細胞外的IgSF域,但胞漿區較短,缺乏能與信號蛋白結合的入塢位點。CD200的受體(CD200R)也包含2個細胞外的IgSF域,它的細胞質區域很大 ,含有酪氨酸殘基,能夠被磷酸化,具有向細胞內轉導信號的能力。CD200分子的活結構決定在其細胞外區域需要與其受體CD200R結合后才能傳導信號,發揮其生物學功能。

    本研究前期工作已經成功的克隆了CD200基因,并構建成真核表達質粒pcDNA3-CD200[8],pcDNA3是一種真核表達載體,其5’端含CMV早期啟動子與增強子,復制啟始位置帶有SV40啟動子,3’端有polyA尾,能將克隆至其中的目的片段高效表達。COS-7是來源于非洲綠猴腎成纖維細胞并經SV40病毒基因轉化的細胞系,能組成型地表達SV40大T抗原,使得任何復制起始位置帶有SV40的轉染質粒能夠以很高的拷貝數進行復制。作為一種真核瞬時表達系統,COS-7是研究蛋白質結構與功能的有利工具。目前,已有多種基因轉移方法可將目的基因導入受體細胞,本實驗選擇電轉染方法,用高于某一個域值的外加瞬間脈沖電場作用于受體細胞,使細胞膜暫時性的吸收外界環境中的DNA分子,與其他轉染方法相比,幾乎沒有生物或化學副作用,并且效率高,重復性強,快捷簡便。為進一步研究CD200分子的活性以及信號傳導和生物學功能,本研究選擇pcDNA3為真核表達載體,利用電轉染的方法,成功地將CD200轉染入COS-7細胞后,表達的產物能夠被抗CD200受體識別,提示其具有生物學活性,為進一步開展基因治療和研制此類基因重組蛋白藥物奠定了實驗基礎。

    【參考文獻】

    1   Wright,GJ. Puklavec, MJ. Willis AC. et al. Lymphoid/neuronal cell surface OX2 glycoprotein recognizes novel receptor on macrophages implicated in the control their function. J Immunity, 2000,(13):233-242.

    2  Gorczynski R M, Chen Z.et al.Increased expression of the novel molecule OX-2 is involved in prolong ation of murine renal allograft survival. Transplantation, 1998,65(8):1106-1114.

    3  Clark, DA.Yu, G.levy, GA.et al. Procoagulants in fetus rejection: the role of the OX-2 (CD200) tolerance signal. J Semin Immunol, 2001,13(4):255-263.

    4  Barclay AN, Wright GJ,Brooke G.et al.CD200 and membrane protein interactions in the control of myeloid cells. Trends Immunol, 2002,23(6): 258-290.

    5  侯治富,高嵩,鄭永晨,等.人CD200基因克隆及pcDNA3-CD200表達質粒構建.吉林大學學報(醫學版),2005,31(2):186-189.

    6  Tekie W, Astumian RD , Chock PB,et al. Selective and asymmetric molecular transport across electroporated cell membranes. Proc Natl Acad Sci USA , 1994, 91(24): 11512-11516.

    7  McMaster WR, Williams AF.Identification of Ia glycoproteins in rat thymus and purification from rat spleen. Eur J Immunlo, 1979, 91(9):426-433.

    8  Jon A Wolff,Robert W Malone,Phillip Williams,et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo,Science .New Series,1990,247(4949):1465-1468.

   作者單位: 1 310033 浙江杭州,浙江大學附屬第二醫院檢驗

    2 310003 浙江杭州,浙江大學醫學院附屬第一醫院 衛生部多器官聯合移植研究重點實驗室

    3 130033 吉林長春,吉林大學中日聯誼醫院中心實驗室 

    (編輯:宋  冰)   


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