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小鼠趨化因子CXCL10真核表達載體的構建

來源:中華醫學研究雜志 作者:李博,李青,趙慶利,魏學斌 ,張新華 ,吳超群,鐘翠 2006-12-18

摘要: 小鼠趨化因子CXCL10真核表達載體的構建 (pdf) 【摘要】 應用RT-PCR方法,從小鼠脾臟T細胞的mRNA中,擴增獲得編碼小鼠趨化因子CXCL10的cDNA,并加上人單核細胞趨化蛋白1的信號肽基因,將其克隆到Pucm-T載體,經酶切及測序鑒定,進而構建CXCL10重組真核表達載體。采用脂質體法體外轉染COS-7真核細胞,經Western blot和趨化......


     小鼠趨化因子CXCL10真核表達載體的構建 (pdf) 

    【摘要】    應用RT-PCR方法,從小鼠脾臟T細胞的mRNA中,擴增獲得編碼小鼠趨化因子CXCL10的cDNA,并加上人單核細胞趨化蛋白1的信號肽基因,將其克隆到Pucm-T載體,經酶切及測序鑒定,進而構建CXCL10重組真核表達載體。采用脂質體法體外轉染COS-7真核細胞,經Western blot和趨化指數檢測,轉染細胞能夠表達CXCL10蛋白,其上清對淋巴細胞具有趨化作用。CXCL10的真核表達載體構建成功,為進一步研究其在腫瘤治療中的作用奠定了基礎。

    【關鍵詞】  CXCL10;基因克隆;真核表達載體

       Gene cloning and eukaryotic expression vector construction of murine CXCL10

    LI Bo, LI Qing, ZHAO Qing-li,et al.Department of Urology, Qianfoshan Hospital of Shandong Province, Jinan,Shandong  250014, China

    【Abstract】   The cDNA fragment encoding the murine CXCL10 was obtained from mRNA of mouse T cells by using reversal transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR)and contained a signal peptide derived from the human monocyte chemoattractant protein 1, then it was cloned into the Pucm-T vector. By partial nucleotide sequencing, the cDNA was consistent with the reported mCXCL10 cDNA in the gene bank, and then was inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). The recombinant plasmid was transfected into COS-7cell line by DOTAP liposome. The expression of the target molecule was assayed by Western blot and chemotaxis assay.It was found that the cells transfected with plasmid vector could express mCXCL10 protein and it’s culture supernatants could attract T cells markedly. The successful construction of mCXCL10 eukaryotic expression vector lays the foundation for it’s further researching in treatment of tumor.

    【Key words】   CXCL10; gene cloning; eukaryotic expression vector

    趨化因子CXCL10 (IFN-γ inducible protein-10, IP-10),屬于CXC家族的非ELR趨化因子,主要由活化的單核及巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞產生。CXCL10的受體CXCR3,屬于具有7個跨膜區的G蛋白偶聯受體,由活化的T細胞等表達,CXCL10與其結合后發揮趨化作用,能夠誘導活化的T細胞等趨化。另外,CXCL10還能夠抑制腫瘤血管生成[1~3]。基于CXCL10的多種生物學效應,國外已開展CXCL10在腫瘤和感染性疾病等方面的應用研究。本實驗旨在構建小鼠CXCL10真核表達質粒,探討其在真核細胞中的表達,為進一步研究CXCL10的生物學活性及腫瘤的基因治療奠定基礎。

    1  材料與方法

    1.1  載體、菌株及主要試劑  大腸桿菌DH5α、Pucm-T載體和真核表達載體pcDNA3.1(+)原購自Invitrogen公司。COS-7細胞購自中科院上海細胞生物所。RT-PCR試劑盒、限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ購自Promega公司。T4DNA連接酶和TaqDNA 聚合酶購自Promega公司。DNA片段回收試劑盒和質粒抽提試劑盒購自華美公司。鼠重組CXCL10細胞因子和兔抗鼠CXCL10多克隆 抗體為PeproTech公司產品,抗兔IgG-HRP為Santa Cruz公司產品。DOTAP脂質體轉染試劑盒購自Roche公司。尼龍毛為日本和光純藥工業株式會社產品。引物合成及測序由上海申能博彩公司完成。

    1.2   CXCL10真核表達載體構建  根據Genebank小鼠CXCL10基因序列(Access AF227743)及相關文獻[3~5]設計引物,為在CXCL10 cDNA加上信號肽基因,設計PCR引物時5’端包含了人單核細胞趨化蛋白1的信號肽序列,由于信號肽基因較長,采用兩步PCR法。常規提取小鼠脾臟細胞總RNA,按照反轉錄試劑盒操作要求完成RT反應合成cDNA第1鏈后,PCR擴增小鼠CXCL10基因,上游引物5’-CCG GAA GCC TCC CCA TCA GCA CC-3’,下游引物5’-TGT GTG CGT GGC TTC TCT CCA-3’(342bp),反應條件為94℃預變性4 min,94℃45s、57℃45s、72℃45s,30個循環后,72℃延伸 10 min。然后以PCR產物為模板,進行巢式PCR的2次擴增,上游引物5’-ATG AAC CCA AGT GCT GCC GTC A-3’,下游引物5’-TTA AGG AGC CCT TTT AGA CCT-3’(297bp),反應條件同上。電泳回收條帶,采用兩步PCR法在5’端加上一個69bp的信號肽基因。5’端引物 有兩條,第一條5’-CTC TTC ATC TCC GGC TCC GCC TTT TCT AGG GGT ATG AAC CCA AGT GCT GCC GTC ATT-3’,第二條5’-TCA CAA GCT TAT GAA GTG GGT AAC CTT TCT CCT CCT CCT CTT CAT CTC CGG CTC CGC CT-3’;3’端引物5’-ATC GAA TTC TTA AGG AGC CCT TTT AGA CCT T-3’,反應條件同上。經T4 DNA連接酶將目的基因連接Pucm-T載體,轉化DH5α感受態菌。經藍白斑篩選,酶切及測序鑒定正確后,酶切插入載體pcDNA3.1(+)的多克隆位點。由于擴增片段兩端設計的酶切位點為EcoRⅠ和HindⅢ,而片段本身也含有一個HindⅢ位點,因此采用部分酶切,先加入EcoRⅠ酶切3 h,再加入HindⅢ酶切5 min或10 min,電泳回收正確片段,與經同樣酶切的pcDNA3.1 (+)連接。將連接產物酶切鑒定并反向測序,確定載體構建準確。

    1.3  體外轉染實驗

    1.3.1   細胞轉染  參考Min WP[6]等的方法,將C XCL10表達載體(2μg)和DOTAP脂質體(8 μl)加入100μl Opti-MEM無血清培養液中混勻,室溫放置45 min后,加入800μl Opti-Mem無血清培養液,使終體積為1ml。緩慢加入已接種COS-7細胞的六孔培養板,邊加邊搖動,37℃、5% CO2 培養4 h后棄混合液,加入完全培養液繼續培養。另設轉染空載體pcDNA3.1(+)的細胞和未轉染細胞作對照組。

    1.3.2   Western blot檢測蛋白的表達  細胞培養48 h后,以甲醇-氯仿法沉淀培養液上清中蛋白。以2×SDS上樣緩沖液裂解細胞,將蛋白沸水變性5 min后垂直電泳。用半干式轉移法將蛋白轉移到PVDF膜上,脫脂牛奶封閉,加兔抗鼠CXCL10多克隆抗體(1:1000),4℃過夜,TTBS洗3遍,再用HRP標記的抗兔二抗(1:1000)室溫下孵育1.5 h,TTBS洗3遍,DBA顯色。

    1.3.3  轉染細胞表達CXCL10的趨化活性檢測  細胞上清參考Xia等[7]的方法測定趨化指數。分離小鼠脾細胞,尼龍毛柱分離T細胞,調整細胞濃度為2×106/ml,趨化池下層的復孔加入各組細胞上清或鼠重組CXCL10細胞因子,上層加入40μl的淋巴細胞懸液,37℃、5% CO2 培養3 h,顯微鏡下計數5個高倍視野,趨化指數=實驗孔中遷移的細胞數/對照孔中遷移的細胞數,趨化指數>2認為對淋巴細胞有趨化作用。

    2  結果

    2.1   CXCL10真核表達載體構建  脾臟細胞總RNA經逆轉錄巢式PCR二次擴增后,瓊脂糖凝膠電泳可見一條約300bp條帶(圖1)。兩步PCR反應后電泳,第二次PCR產物含信號肽序列,比第一次PCR略長,約370bp(圖2)。將擴增片段與T載體連接、轉化后,酶切及測序鑒定正確。由于擴增片段兩端的酶切位點為EcoRⅠ和HindⅢ,而片段本身也含有一個HindⅢ位點,且T載體本身也有這兩個酶切位點,酶切后片段較多,但仍可回收正確的目的片段(圖3)。與經同樣酶切的pcDNA3.1(+)連接后反向測序鑒定,表明CXCL10基因加上了人單核細胞趨化蛋白1的信號肽序列,有EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位點,且mCXCL10基因序列與Genebank所示一致,說明所構建的真核表達載體正確。

    2.2  轉染細胞表達CXCL10蛋白的檢測  采用Western blot分別檢測轉染CXCL10表達載體的細胞及其培養上清中CXCL10的表達,均可檢測到CXCL10蛋白;而轉染空載體組和未轉染組細胞均未能檢測到CXCL10存在(圖4)。

    2.3  CXCL10趨化功能檢測  轉染CXCL10表達載體細胞上清的趨化指數為2.7±0.3,對淋巴細胞有明顯趨化作用;而兩對照組細胞上清的趨化指數均小于2,對淋巴細胞無趨化作用。

    3  討論

    CXCL10基因由IFN-γ誘導,其生物學功能包括抑制造血細胞集落形成,趨化單核細胞、活化的T細胞和NK細胞,刺激T細胞粘附內皮細胞以及NK細胞介導的細胞融解,抑制血管生成等[8]。研究顯示免疫系統能夠排斥穩定轉染并表達CXCL10的腫瘤細胞[9],CXCL10還能夠抑制腫瘤血管生成[8]。因此CXCL10的抗腫瘤作用是通過趨化T細胞的免疫反應和抑制血管生成的非免疫反應完成的。另有文獻報道,CXCL10與細胞因子IL-12或IL-18聯合應用,可以明顯增強抗腫瘤作用[2]。

    為了使轉染CXCL10基因的細胞能更有效的將CXCL10蛋白分泌到細胞外,我們用PCR法在目的基因片段上添加了單核細胞趨化蛋白1的信號肽基因,該信號肽基因具有引物設計方便,PCR反應簡單,信號肽跨膜轉運功能強的特點[4,5]。測序結果表明,目的基因已包含了單核細胞趨化蛋白1的信號肽序列,有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA,序列結果正確,證明信號肽基因已加在CXCL10cDNA上。Western blot和趨化功能檢測表明轉染成功,分泌的因子具有功能活性,對淋巴細胞具有明顯趨化作用,說明該信號肽具有將CXCL10跨膜轉移到細胞外的功能。本實驗為進一步深入研究CXCL10對淋巴細胞的趨化活性及其在抗腫瘤治療中的作用提供了可能。

    【參考文獻】

    1  Dufour JH, Dziejman M, Liu MT,et al. IFN-gamma-inducible protein 10 (CXCL10;CXCL10)-deficient mice reveal a role for CXCL10 in effector T cell generation and trafficking. J Immunol,2002,168:3195.

    2   Liu Y, Huang H, Saxena A,et al. Intratumoral coinjection of two adenoviral vectors expressing functional interleukin-18 and inducible protein-10, respectively, synergizes to facilitate regression of established tumors. Cancer Gene Ther,2002,9:533.

    3  Giese NA, Raykov Z, DeMartino L,et al. Suppression of metastatic hemangiosarcoma by a parvovirus MVMp vector transducing the CXCL10 chemokine into immunocompetent mice. Cancer Gene Ther,2002, 9:432.

    4  Chen QR, Kumar D, Stass SA,et al. Liposomes complexed to plasmids encoding angiostatin and endostatin inhibit breast cancer in nude mice. Cancer Res,1999, 59:3308.

    5  Sargent TD, Yang M, Bonner J.Nucleotide sequence of cloned rat serum albumin messenger RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1981,78: 243.

    6  Min WP, Gorczynski R, Huang XY,et al. Dendritic cells genetically engineered to express Fas ligand induce donor-specific hyporesponsiveness and prolong allograft survival. J Immunol,2000, 164:161.

    7  Xia DJ, Zhang WP, Zheng S,et al. Lymphotactin cotransfection enhances the therapeutic efficacy of dendritic cells genetically modified with melanoma antigen gp100. Gene Ther,2002, 9:592.

    8  Sgadari C, Angiolillo AL, Cherney BW,et al. Interferon-inducible protein-10 identified as a mediator of tumor necrosis in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:13791.

    9  Luster AD, Leder P. CXCL10, a C-X-C chemokine, elicits a potent thymus-dependent antitumor response in vivo. J Exp Med, 1993,178:1057.

    (*基金項目:2005年山東省醫藥衛生科研項目(編號:2005HW124)

    作者單位: 1 250014 山東濟南,山東省千佛山醫院泌尿外科

    2 200032 上海,復旦大學上海醫學院解剖組胚系

    3 200433 上海,復旦大學遺傳研究所

    (編輯:悅  銘)


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