當前位置:Home > 醫源資料庫 > 在線期刊 > 中華醫學研究雜志 > 2006年第6卷第12期 > 酶放大鑭系元素發光時間分辨熒光分析中 關鍵試劑的研究

酶放大鑭系元素發光時間分辨熒光分析中 關鍵試劑的研究

來源:中華醫學研究雜志 作者:宋娜玲,趙啟仁,李美佳,褚麗萍,莊湘蓮,顏廷東,賀 2006-12-18

摘要: 酶放大鑭系元素發光時間分辨熒光分析中 關鍵試劑的研究 (pdf) 【摘要】 目的 研制成鑭系元素發光時間分辨熒光分析中的關鍵試劑。結果 HRP標記SA總蛋白回收率為29。ALP標記SA的總蛋白回收率為56%,純度為98%,分子量為159kD,其中ALP分子量為94kD,生物活性良好。 Methods Horseradish peroxidase-labeled streptavidin (......


     酶放大鑭系元素發光時間分辨熒光分析中 關鍵試劑的研究 (pdf) 

    【摘要】  目的  研制成鑭系元素發光時間分辨熒光分析中的關鍵試劑。 方法  用過碘酸鈉法研制成辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素,用戊二醛二步法研制成堿性磷酸酶標記鏈霉親和素和用化學合成法研制成5-氟水楊酸磷酸酯等關鍵試劑。結果  HRP標記SA總蛋白回收率為29.8%,純度為97%。ALP標記SA的總蛋白回收率為56%,純度為98%,分子量為159kD,其中ALP分子量為94kD,生物活性良好。5-氟水楊酸磷酸酯,測得熔點為157℃~159℃、純度為99.43%~100%、紅外吸收光譜、紫外吸收光譜及核磁共振譜等特性鑒定與文獻記載一致。結論  研制成的各種關鍵試劑質量良好,已成功地應用于科研中。

    【關鍵詞】  酶放大鑭系元素發光;辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素;堿性磷酸酶標記鏈霉親和素;5-氟水楊酸磷酸酯

      The studies of the key reagents for enzyme-amplified lanthanide luminescence time-resolved fluorescence assay

    SONG Na-ling,ZHAO Qi-ren,LI Mei-jia,et al. The Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine, Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300192,China

    【Abstract】  Objective  The key reagents were studied for enzyme-amplified  lanthanide luminescence (EALL) time-resolved fluorescence assay (TRFA).  Methods  Horseradish peroxidase-labeled streptavidin (HRP-SA) was developed by sodium periodate method, alkaline phosphatase-labeled streptavidin (ALP-SA) was developed by two steps method of glutaraldehyde and 5-fluorosalicyl phosphate(5-FSAP) was synthesized chemically. Results  The recovery rate of total protein of HRP-SA was 29.8%, purity was 97%. The recovery rate of total protein of ALP-SA was 56%, purity was 98%, the molecular weight was 94kD, biological activity was good. Determined 5-FASP melting point was 157℃~159℃, purity was 99.43%~100%, the characters of infrared absorption spectrum, ultra-violet absorption spectrum and nuclear magnetic resonance spectrum accorded with literature recordation. Conclusion  The developed key reagents had good quality and were used successfully in EALL FRFA.

    【Key words】  enzyme-amplified lanthanide luminescence; horseradish peroxidase-labeled streptavidin; alkaline phosphatase-labeled streptavidin; 5-fluorosalicyl phosphate

    鑭系元素發光時間分辨熒光分析(lanthanide luminescence timie-resolved fluorescence assay)廣泛地應用于蛋白和核酸分析中。用于核酸雜交分析時,這種分析方法的基本原理如下[1~3]:先用抗體包被微滴定孔,再經特異抗原標記的靶DNA與該抗體反應,將靶DNA連接到固相抗體上。然后用生物素化探針與靶DNA雜交,再通過生物素(B)與鏈霉親和素(SA)的反應,將鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶(HRP-SA)連接到雜化物上。當加入含有H2O2和生物素化酪胺(B-T)的HRP的底物溶液,因有H2O2存在,HRP在催化酪胺氧化,產生游離基團的同時,也催化事先固定在微滴定孔表面的蛋白質(如白蛋白)的酪胺酰基的氧化。由于二聚體形成反應,于是生物素化酪胺(B-T)就共價地結合到固相上。再加入堿性磷酸酶標記鏈霉親和素   (ALP-SA), 經B與SA的反應,ALP結合到固相上。至 此,實現了雜交和建立了雜交的定量關系。洗滌后,加入ALP的底物5-氟水楊酸磷酸酯(5-FSAP),ALP作用于5-FSAP,產物為5-氟水楊酸(5-FSA),再加發展溶液,5-FSA與發展溶液中的Tb和EDTA形成發射高產額、長熒光壽命的5-FSA:Tb:EDTA三元復合物。由于,過量的5-FASP和Tb-EDTA都不干擾信號測量,可用時間分辨熒光儀直接測量熒光強度,確定待測DNA的量,而無需另行分離,方法很簡單。本分析系統主要包括關鍵試劑的研制和分析系統的建立,本文介紹了HRP標記SA、ALP標記SA和5-FSAP等關鍵試劑的研制。

    1  材料與方法

    1.1  材料  戊二醛,天津市大茂化學試劑廠;堿性磷酸酶,美國Sigma公司;鏈霉親和素,美國Promega公司;標準蛋白,Phast Gel Gradient 8%~25%和Agarose IEF,瑞典Pharmacia Biotech公司;高碘酸鈉,硼氫化鉀,天津市大茂化學試劑廠;對-氟茴香醚,Sigma公司;紫外分光光度儀(DU 800型),美國Beckman公司;Phast system水平電泳儀,瑞典Pharmacia Biotech公司;自動分部收集器(BS-100型),上海瀘西儀器廠;離心機(LD5-2A型),北京醫療離心機廠。

    1.2  方法

    1.2.1  辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素  采用過碘酸鈉法。過碘酸鈉是強氧化劑,能將HRP的甘露糖部分(與酶活性無關的部分)的羥基氧化成醛基,然后與SA的氨基結合,形成HRP-SA。HRP 1mg與60mmol/L NaIO4 0.1ml于4℃作用20min,加入0.16mol/L乙二醇0.1ml 30min后,加SA 1mg,4℃靜置24h,透析過夜,加等體積的飽和硫酸銨溶液,4000r/min離心15min,將沉淀物溶解于pH 7.4的PBS中。280nm下測吸光度并進行200~800nm波長掃描。

    用sephadex G-75裝柱。HRP-SA上樣100μl,用0.025mol/L KCl-0.2mol/L乙酸緩沖液以0.5ml/2min的速度淋洗,分部收集。用DU800紫外分光光度計測量收集的各管樣品的OD280值,繪制柱層析圖譜(洗脫曲線),據此收集蛋白峰。透析脫鹽和用PEG-2000進行濃縮。

    1.2.2  堿性磷酸酶標記鏈霉親和素  采用戊二醛二步法。在ALP中加入過量戊二醛,戊二醛的一個醛基即與ALP的氨基結合,充分透析除去未結合戊二醛,加SA與結合了ALP的戊二醛的另一個醛基結合。取133μl含1.25%戊二醛的0.1M PB(pH=6.8),加入0.5ml ALP(1.667mg)中,混勻, 22℃過夜反應,透析。加入1.0mg SA和67μl 1M Na2CO3-NaHCO3緩沖液,混勻,置4℃下反應24h。加入7μl 0.2mol/L賴氨酸溶液反應2h,終止反應。用0.05M PBS(pH=7.2)緩沖液4℃下透析12h脫鹽,4000r/min離心15min,取出上清液置4℃保存備用。280nm下測吸光度并進行200~800nm波長掃描。

    純化方法與1.2.1的相同,ALP-SA上樣100μl。采用考馬斯亮藍G-250染色法進行了蛋白濃度的測定[4,5]。

    為了測定ALP-SA的分子量,進行了聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳[6]和SDS-聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳。配制濃度為1.022mg/ml ALP-SA電泳儲備液、1.084mg/ml HRP-SA電泳儲備液和1.086mg/ml B-T電泳儲備液。然后制備相應的電泳樣品,在Phast Gel Homogeneous 12.5凝膠片上上樣,每個樣品4μl。

    將SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳結合測定SA-ALP分子量。在20μl SA-ALP原液中加入60μl樣品溶解液和20μl 60%蔗糖溶液,混勻。將標準蛋白10μl和加入樣品溶解液的樣品分別用混勻器混勻,100℃上加熱5min后,2500轉/min離心5min。在Phast Gel 梯度8%~25%凝膠片上上樣,每個樣品4μl。

    1.2.3  5-氟水楊酸磷酸酯(5-FSAP)合成[7]  以對-氟茴香醚(Ⅰ)為原料,與乙酰氯在無水三氯化鋁的存在下反應得到5-氟-2-甲氧基苯乙酮(Ⅱ),將(Ⅱ)用氧化劑次溴酸鈉氧化得到5-氟-2-甲氧基苯甲酸(Ⅲ),脫甲基后得到5-氟水楊酸(Ⅳ)。(Ⅳ)與五氯化磷作用得到5-氟-苯甲酸-2-磷酸酯,即5-FSAP。

    5-FSAP的紅外光譜分析:委托南開大學中心實驗室作5-FSAP紅外光譜。儀器:MAGNA-560FT-IR (Nicolet公司),即:MAGNA-560付里葉變換紅外光譜儀(美國尼高力公司)。方法: KBr壓片法。

    5-FSAP核磁共振圖譜分析[8]:委托南開大學核磁實驗室作了5-FSAP的1H核磁共振圖譜和31P核磁共振圖譜,儀器:Bruker AC-P200 MHZ核磁儀。

    5-FSAP的紫外光譜分析:用0.01mol/L HCl作溶劑,使用Beckman公司DU 800紫外分光光度計測量5-FSAP在200~800nm波段的吸收光譜。

    薄板層析法檢測5-FSAP的純度:用硅膠GF254鋪板,使用雙波紫外燈(254,365nm)觀察結果。用丙酮:氯仿:冰乙酸(2:2:0.5)作展開劑,分別用5-FSAP、5-FSA點樣,使用雙波紫外燈觀察結果。使用丙酮:氯仿(1:1)作展開劑,使用雙波紫外燈。

    高效液相色譜法測定純度:使用Backman高效液相色譜儀和C18分析柱(5u,4.6mm×25cm),流動相為10%甲醇,流速1ml/min,UV 280nm檢測,測量5-FSAP含量。

    5-FSAP熔點觀察:使用BüCHI 535型熔點測定儀,測量5-FSAP的熔點。

    2  結果

    2.1  HRP-SA  取HRP-SA 10μl,去離子雙蒸水稀釋10倍,用紫外分光光度計在200~800nm波段進行掃描。其中,在230nm處有最大吸收峰,可能是溶劑的吸收峰;在280nm有次吸收峰,這是HRP-SA吸收峰。測量280nm處吸光度,OD280為1.0851。離心后上清液共150μl溶液,則獲得的蛋白質總量為1.1382mg。投料總蛋白質為2 mg,收率為56.91%。

    HRP-SA的Sephadex G-75凝膠柱層析分部收集得88管淋洗溶液,用紫外分光光度計分別測量這88管淋洗溶液在280nm處吸光度,作吸光度圖,見圖1。其中主峰主要集中在第6管至第10管,共5管,蛋白的總標記收率為29.8%,純度約為97%。收集這5管的淋洗溶液,透析脫鹽并濃縮。

    2.2  ALP-SA  ALP-SA標記實驗后,將離心后上清液取10μl,去離子雙蒸水稀釋10倍,用紫外分光光度計在200~800nm波段進行掃描。其中,在230nm處有最大吸收峰,可能是溶劑的吸收峰;在280nm有次吸收峰,這是SA-ALP吸收峰,OD280為1.5631。離心后上清液共200μl溶液,則獲得的蛋白質總量為2.186mg。投料總蛋白質為2.667mg,收率為81.9%。

    ALP-SA的Sephadex G-75凝膠柱層析分部收集得54管淋洗溶液,用紫外分光光度計分別測量這54管淋洗溶液在280nm處吸光度,作吸光度圖,見圖2。其中主峰主要集中在第5管至14管,純度約為98%。收集這10管的淋洗溶液,透析脫鹽并濃縮后獲得150μl ALP-SA溶液,含ALP-SA 1.533mg,純化收率為70.1%。所以蛋白標記總收率為56%。

    對ALP-SA進行聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳,低分子量標準蛋白作參照,所得電泳圖譜示于圖3:其中,1為ALP- SA,濃度為465ng/μl;2為ALP -SA,濃度為300ng/μl;3為標準蛋白LMW Marker,濃度為1μg/μl;4為HRP-SA,濃度為493ng/μl;5為HRP-SA,濃度為320ng/μl;6為B-T,濃度為320ng/μl。

    低分子量標準蛋白LMW Marker蛋白質分子量范圍為14.4~94kD。在圖3中,可以看到的標準蛋白只有3條帶,因為電泳時間過長,低分子量的蛋白跑出了凝膠外。而SA-ALP遷移較小則是因為分子量太大。

    SA分子量大約65kD,ALP分子量未知。而對應的HRP-SA中,HRP分子量為40kD,那么HRP-SA分子量則應在105kD左右。在圖3中,4和5兩條帶為HRP-SA的電泳帶,其位置在SA-ALP電泳帶前,所以,ALP-SA分子量應大于105kD。另外,ALP-SA只有一條電泳帶,則可以說明合成的ALP-SA純度很高,沒有其他蛋白質雜質。

    為了更好的判斷ALP-SA分子量,我們又作了SDS-聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳,同時選用了高分子量標準蛋白和低分子量標注蛋白作參照,結果見圖4。

    圖4中,1和5為濃度不同的低分子量標準蛋白,3是高分子量標準蛋白,2和4則是濃度不同的ALP -SA。低分子量標準蛋白LMW Marker蛋白質分子量范圍為14.4~94kD;高分子量標準蛋白HMW Marker中蛋白質分子量范圍為53~212kD。

    SA-ALP有兩條染色條帶,分子量分別在65kD和94kD左右,考慮到SA的分子量為65kD,說明在電泳過程中SA-ALP發生了解離。所以,另一條染色條帶應為ALP,即ALP分子量約為94kD。這樣研制成的ALP-SA的分子量應為159kD。

    2.3  5-FSAP  5-FSAP的紅外光譜分析圖譜見圖5。紅外光譜IR(KBr,cm-1)2858~3079、1693、1590、1492、1458、1285、1192、1040、981、907、836,數據與文獻值一致(分辨率:4cm-1,波數范圍: 4000~400cm-1,掃描次數:20次)。

    5-FSAP核磁共振圖譜分析:分別作了1H NMR和31P NMR。1H NMR(D2O作溶劑,TMS內標)圖譜,δ(ppm)7.26-7.33(m,2H),7.46-7.53(m,1H);5-FSAP的31P NMR(D2O作溶劑,TMS內標)圖譜,δ(ppm)-3.94,數據均與文獻值一致。

    5-FSAP的紫外光譜分析:用HCl作溶劑,在紫外分光光度計上作200~800nm波段掃描。5-FSAP在280nm處有最大吸收峰,和文獻記載值一致;其中在200nm處的吸收峰,為溶劑成分吸收峰。

    薄板層析法檢測5-FSAP的純度:使用丙酮:氯仿:冰乙酸(2:2:0.5)作展開劑,5-FSAP點樣,5-FSAP仍然在原點,沒有移動擴散,雙波紫外燈(254,365nm)觀測下顯紫色斑點,不存在原料或其他中間產物。使用5-FSA點樣,相同情況下,5-FSA移動,接近展開劑展開前沿,雙波紫外燈下顯淡紫白色斑點。用丙酮:氯仿(1:1)作展開劑時,得到上述類似結果。

    高效液相色譜測定純度:使用Backman高效液相色譜儀和C18分析柱(5u,4.6mm×25cm),流動相10%甲醇,流速1ml/min,UV280nm檢測,不同批號5-FSAP的純度在99.43%~100%。

    5-FSAP熔點測定:使用BüCHI 535型熔點測定儀,測量5-FSAP熔點為157℃~159℃,同文獻值相符。測量不同批號、不同存放溫度和不同存放時間的5-FSAP的熔點,其熔點變化不大,所合成的5-FSAP比較穩定。

    3  討論

    酶標記SA的制備方法主要有兩種,即戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。對于辣根過氧化物酶的標記,我們采用過碘酸鹽氧化法,這種方法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基,醛基與SA分子上的氨基形成Schiff堿而結合。后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記物。

    在電泳測定SA-ALP分子量中,開始先進行了聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳,這是測定蛋白質分子量比較好的方法。可是,由于標準蛋白選擇了低分子量,而SA-ALP分子量太大,因此,電泳結果不夠理想(見圖3),低分子量標準蛋白超出了凝膠范圍,而SA-ALP遷移較小,無法判斷其分子量。但是,在這次結果中,我們可以看出SA-ALP電泳帶只有一條,證明合成的SA-ALP純度很高,沒有其他蛋白質雜質。

    后來進行了SDS-聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是測定蛋白質亞基分子量比較好的方法。我們在進行這次電泳前,考慮到了電泳過程中,SA-ALP會解離。因為處理樣品需要100℃加熱5min且樣品溶解液中含有SDS 和β-巰基乙醇,β-巰基乙醇是蛋白質分子中二硫鍵的還原劑,使多肽組分分成單個亞單位;SDS可打斷蛋白質的氫鍵,與蛋白質結合后,可引起蛋白質構象的改變。因此,在電泳結果(見圖4)中可以看到SA-ALP出現兩條帶,其中一條帶分子量大約65kD,另一條帶分子量大約94kD。而我們知道,SA分子量正是65kD,那么另一條帶就是解離下來的ALP,其分子量大約94kD。這樣,我們可以推算SA-ALP的分子量應為159kD左右。結合圖4,SA-ALP的電泳結果與低分子量標準蛋白中分子量最高為94kD的Phosphorylase和分子量大約為105kD的HRP-SA的電泳結果相比,其位置基本與其分子量相符。

    4  結論

    成功地合成了核酸雜交的鑭系元素發光時間分辨熒光分析中的HRP標記SA、ALP標記SA和5-FSAP等關鍵試劑,為核酸雜交的鑭系元素發光時間分辨熒光分析系統的建立打下了很好的基礎。(本文圖片見封三)

    【參考文獻】

    1  Campbell CN, Gal D, Cristler N, et al. Enzyme-amplified amperometric sandwich test for RNA and DNA. Anal Chem, 2002, 74(1):158-162.

    2  Meyer J, Karst U. Enzyme-linked immunosorbent assays based on peroxidase labels and enzyme-amplified lanthanide luminescence detection. Analyst, 2001, 126(2): 175-178.

    3  Evangelista RA, Pollak A, Templeton EG. Enzyme-amplified lanthanide luminescence for enzyme detection in bioanalytical assays. Anal Biochem, 1991, 197:213-224.

    4  盧圣棟.現代分子生物學實驗技術.北京:中國協和醫科大學出版社,1999.

    5  趙亞力,馬學斌,韓為東.分子生物學基本實驗技術.北京:清華大學出版社, 2006,.

    6  Rothe GM, Purkanbaba H. Electrophoresis. 1982(3): 33-42.

    7  Lacock RC. Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Function Group Preparation. Wiley-VCH, 1999, New York.

    8  方惠群,于俊生,史堅.儀器分析.北京:科學出版社, 2002.

    *基金項目:天津市自然科學基金(批準號:043610211)

    作者單位:300192 天津,中國醫學科學院 中國協和醫科大學放射醫學研究所,天津市分子核醫學重點實驗室

   (編輯:秋  實) 


醫學百科App—醫學基礎知識學習工具


頁:
返回頂部】【打印本文】【放入收藏夾】【收藏到新浪】【發布評論



察看關于《酶放大鑭系元素發光時間分辨熒光分析中 關鍵試劑的研究》的討論


關閉

網站地圖 | RSS訂閱 | 圖文 | 版權說明 | 友情鏈接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 醫源世界 版權所有
醫源世界所刊載之內容一般僅用于教育目的。您從醫源世界獲取的信息不得直接用于診斷、治療疾病或應對您的健康問題。如果您懷疑自己有健康問題,請直接咨詢您的保健醫生。醫源世界、作者、編輯都將不負任何責任和義務。
本站內容來源于網絡,轉載僅為傳播信息促進醫藥行業發展,如果我們的行為侵犯了您的權益,請及時與我們聯系我們將在收到通知后妥善處理該部分內容