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骨髓間充質干細胞移植治療心肌梗死時機再探討

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:王振河,王挹青 2008-7-4

摘要: 間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是中胚層來源的具有自我更新及多向分化能力的干細胞,主要存在于全身結締組織和器官間質中,以骨髓組織中含量最為豐富。近年來其在心肌梗死修復中的作用已有多方面的研究,多種細胞因子、骨髓間充質干細胞的培養代數、心肌梗死后的炎癥因子及不同時間點的組織內環境等均可......


  間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是中胚層來源的具有自我更新及多向分化能力的干細胞,主要存在于全身結締組織和器官間質中,以骨髓組織中含量最為豐富。在一定的誘導條件下能分化為成骨細胞、成軟骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、內皮細胞、神經細胞、骨骼肌細胞及心肌細胞等。近年來其在心肌梗死修復中的作用已有多方面的研究,多種細胞因子、骨髓間充質干細胞的培養代數、心肌梗死后的炎癥因子及不同時間點的組織內環境等均可以影響移植的MSCs的增值與分化,本文就從以上幾方面探討移植時機對梗死心肌修復的影響。

    1  骨髓間充質干細胞的生物學特性
                       
  結合目前研究,MSCs 具有如下特點: (1)MSCs容易在體外分離培養:將骨髓自髓腔取出后,接種至培養基進行細胞培養, 培養1h以上, 貼附于培養瓶壁的細胞即為MSCs。接種之前采用相應抗體除去骨髓中造血細胞和內皮細胞可提高分離方法的特異性[1]。(2)不受體內免疫系統的影響: Le Blanc 等[2] 檢測體外分離培養MSCs與T細胞的相互作用, 結果未發現增殖性抗原。Saito 等[3]人發現, 取自C57BL/6小鼠的MSCs經靜脈植入成年Lewis大鼠體內, 至少3個月內, 預先標記的MSCs 向骨髓轉移而并不引起排斥反應;(3)無特異性的表面標記: 現在所發現的一些表面標記并不適合用作為確認某種或某類干細胞的手段, 因為這些標記在非干細胞也能表達,或者一些特異的標記只在某種干細胞的某一特定階段表達, 例如位于HSC 上的CD34。在MSC上, 發現了大量的表面標志物, 如CD13, CD29, CD44, CD51,CD58, CD71, CD73, CD90, CD123, CD124, CD126, CD127,CD166, TGFbIIR, HLA-A, B, C, SSEA-3, SSEA-4, D7 等等,接下來的工作是, 確認是否有MSCs表面標志物, 如有能否作為分析和檢測干細胞, 并作細胞分離依據。
   
 2  骨髓間充質干細胞移植修復梗死心肌的機制

    MSCs移植修復心肌梗死的可能機制如下:(1) MSCs通過直接轉化為心肌細胞修復梗死心肌組織[4];(2)移植的MSCs在梗死心肌組織內形成浦肯野纖維,促進心肌修復[5];(3)移植的MSCs形成心肌連接蛋白并且形成功能性的連接,促進梗死心肌修復[6];(4)移植的MSCs通過促進梗死心肌血管增生的影響改善心肌功能[7];(5)移植的MSCs通過旁分泌作用產生多種細胞因子,促進梗死心肌的修復作用[9]。MSCs移植的不同時期或多或少的都對以上機制產生影響,從而影響骨髓間充質干細胞在心肌梗死中的修復作用。

    3  移植時期對梗死心肌修復功能的影響

    3.1  細胞培養代數及是否純化對梗死心肌修復的影響                  
  比較不同時間貼壁細胞的生長增殖和形態的變化,目前廣泛認為以選用早期貼壁—4~24h貼壁細胞進行培養最合適。在MSCs傳代培養過程中發現:第4~5代之前的細胞增殖能力比較旺盛,以后其活力逐漸減弱,提示細胞脫離了體內環境之后,逐漸發生退化。 Mandana Mohyeddin Bonab[9]等通過試驗研究發現:體外培養的MSCs,在體外培養6代以后,其分化為其他細胞的能力顯著下降,因此,取用MSCs做實驗研究時,細胞的傳代次數不宜超過4~5代.;Farida Djouad[10]等分別將純化的與未純化的MSCs注射入小鼠的心肌組織,證明純化的MSCs具有免疫耐受性,不用加免疫抑制劑即可在同種異體間進行移植,而未經純化的MSCs則可引起免疫排斥反應,不能在同種異體間的正常心肌組織內存活。所以細胞的傳代時期及是否純化也對MSCs移植后的分化產生重要影響。

    3.2  細胞因子及組織微環境對骨髓間充質細胞移植最佳時期的影響     

  Francisco[11~14] 等人用實驗觀察了細胞因子對MSC增殖的影響,發現INF-γ(γ干擾素)、TNF-α(腫瘤壞死因子)、SCF(干細胞因子)和IGF-1(胰島素樣生長因子)明顯促進細胞的增殖,而IL-4、IL-1,bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)對細胞的生長無影響。   
Abbott[15]等證明SCF作為一種作用于早期造血細胞的細胞因子,也加速MSCs的增殖并作為心肌梗死修復中一種重要的細胞因子,但不是單獨足夠的因子,還需要其他細胞因子的共同參與。Tao-Sheng Li[14]等發現干細胞轉化生長因子B也可以促進MSCs在心臟組織中的分化及促進心肌梗死的重建作用,實驗組心肌梗死后bFGF 產生量迅速增加,梗死區bFGF的表達在梗死后第7天達高峰,28 天開始下降,42 天和56 天時表達明顯下降,新生毛細血管密度與兩者產生量成正相關, 與對照組比較差異有統計學意義;Francisco[    11、12、15、16]等發現干細胞因子可以增強MSCs表達心肌特異性肌節肌球蛋白重鏈(MHC)及肌鈣蛋白T(TNT)的表達,從而可以促進MSCs向心肌細胞的分化:Yang JF[16]等通過實驗證明在梗死心肌注射血管內皮細胞生長因子(VEGF165)及促血管生成素(Ang-1)可以顯著改善心肌梗死大鼠心臟功能,其與干細胞的動員有密切關系,實驗組心肌梗死區VEGF 及Ang-1的表達在梗死后第7天達高峰,28 天開始下降,42 天和56 天時表達明顯下降。Ma J [17]等發現,心肌梗死的急性期,機體啟動自限性修復過程,局部血管內皮細胞在缺血狀態下分泌可以促進MSCs向心肌梗死部位歸巢的基質細胞因子(SDF-1),從而促進骨髓干向心肌梗死區歸巢,改善心肌梗死區域的心室重構及血管再生,心肌梗死后1d SDF- 1表達最高,為(2.62±0.28)ng/ml,7d時為(0.24±0.11)ng/ml,濃度迅速降低,兩者比較P<0.01,至14天時已檢測不到SDF- 1 的表達。

    3.3  其他正常心肌細胞存在的機械牽拉作用及正常與梗死心肌組織對MSCs分化為心肌組織的影響     

  Niu LL[18]等將分離純化后的小鼠MSCs移植進入正常的與梗死的小鼠心肌組織內,發現在梗死的心肌組織內小鼠的MSCs分化為心肌細胞,而在正常的小鼠心肌組織內則不發生分化。Meifeng Xu[19]等用實驗證明,當BMSCs與肌細胞一起培養時,BMSCs轉化為既有心肌表型的細胞,分化的肌細胞表達心肌轉錄因子GATA-4和心肌加強因子2,而相應的沒有與肌細胞一起培養的BMSCs則為陰性。Jan Kajstura[20]等證明BMSCs的分化需要心肌細胞之間的融合。Rangappa S[21], Sunil Rangappa[22]等證明與CM直接接觸前提下, CM對MSCs的機械牽拉為誘導MSCs分化為心肌細胞的必須條件,而單純的心肌細胞條件培養液則非關鍵因素。 Gui-Rong Li [23]等分別用四種培養基對MSCs進行培養,證明心肌細胞溶菌產物是一個理想的MSCs分化為心肌細胞的誘導物,其促分化作用比5-氮雜胞苷更為明顯。

    3.4  炎癥反應對MSCs移植時期的影響     

  曹豐[24]等證明(1)心肌梗死后1周內炎癥反應強烈,中性粒細胞及網狀內皮吞噬系統功能活躍,非特異性殺傷自體及異體細胞,移植細胞的生存環境較差,對存活不利; (2)在梗死早期炎癥反應尚未開始時(1h內)進行MSC 移植以及梗死后2~4周細胞移植,細胞存活率高。其2周組的左室收縮末壓力,左室最大上升速率及瘢痕面積百分比的改善顯著優于1h和4周移植組。

    3.5  干細胞移植不同時期對梗死心肌血管生成的影響 

  Boyle[25]等闡述早期的臨床實驗認為是移植的干細胞本身的增值造成梗死心肌的修復,而新近的研究則認為是移植進入的外源干細胞通過新的血管形成作用刺激內源性的心肌細胞或者干細胞增殖,從而修復梗死的心肌組織。Strauer[26]等首次證明在臨床條件下有選擇性的經冠狀動脈植入自體BMCs是安全和有效的,其顯著的治療功能歸功于BMCs相關的心肌重建跟血管再生功能。Linke [27]通過移植自體BMCs在狗心肌梗死自身修復與重建作用中的研究證明:成年動物的心臟屬于自我更新器官,擁有強大的生長儲備,可以逐漸修復被破壞的和已經失去的心肌組織。Oswald J[28] ,Sheng XG [29] ,Fang LJ [30]等通過在體內外的實驗證明MSCs可以分化為血管內皮細胞,可以作為心肌細胞重建的基礎,成為MSCs修復心肌細胞的機制之一。Jian-an Wang[31]等于梗死心肌內注射經BrdU標志的自體骨髓干細胞,4周后發現移植組壞死區內有大量的血管生成(24+-5/HPE),而對照組卻較少發現血管生成(11+-1/HP);Luciano C. Amado [32]在心肌梗死后3天將體外培養的MSCs移植進入梗死的心肌組織,結果發現與對照組相比,移植組的左室功能及收縮面積得到顯著改善。呂菁君[33]等分別在心肌梗死后1周、2周、4周、8周、12周將BrdU標志的骨髓單個核細胞直接注射至梗死心肌周邊區域,結果發現,在心肌梗死后4周內進行干細胞移植在心功能、心肌梗死面積方面優于AMI后8周、12周移植。證明AMI后1~4周可能是較佳的移植時間;其可能機制為BM-MNCs分化為血管平滑肌細胞和血管內皮細胞,直接形成新的血管以拯救瀕臨凋亡的心肌組織;并且BM-MNCs以自分泌或旁分泌的方式分泌多種促進血管生成的細胞因子,促進原始血管從已存在的血管形成新的毛細血管,以改善側支循環。
   
  綜上所述,影響干細胞在心肌梗死后的存活及對梗死心肌的改善功能的方面可分為:(1)干細胞方面;(2)梗死的心肌所產生的組織微環境及各種細胞因子對移植后干細胞的影響等方面;(3)移植時間對梗死心肌血管生成方面等。選用早期貼壁、傳代4~5代的細胞增殖能力較旺盛,也利于純化;在心肌梗死后1周左右,患者血液中各種促進MSCs向梗死心肌歸巢的細胞因子濃度達最高;在心肌梗死后早期(1周以內),尚未完全梗死的心肌細胞可對移植的MSCs產生牽拉作用,有利于梗死心肌的修復;在梗死早期炎癥反應尚未開始時進行MSC 移植(1h內)以及梗死后2~4周行細胞移植,梗死區的炎癥反應對移植的MSCs影響較小,細胞存活率高;AMI后1~4周進行MSCs移植,其對梗死區血管生成的作用最大,促進新生血管的形成,從而改善側支循環,可能是較佳的移植時間;綜合以上多種因素,在心肌梗死后1周左右進行MSCs移植,其對梗死心肌功能改善的作用最大。

    4  問題與展望
       
  目前干細胞移植時期存在的問題主要在于:(1)已經有較多的研究證明MSCs移植可以有效地改善梗死的心臟功能及可以有效改善心室重構,但是有關干細胞移植時期對梗死心臟組織修復影響方面的研究目前還較少。(2)關于心梗后影響MSCs移植定向與分化的各種細胞因子在受體心肌組織或血液中出現的具體時間目前還不完全清楚,各個實驗室的檢查結果之間也有差異。(3)雖然有試驗證明正常的心肌組織的存在可以促進MSCs向心肌細胞的分化,但是也有試驗證明梗死的心肌組織才更有效的促進MSCs的分化,是否這兩種作用同時存在,哪一種作用較大,目前還不完全清楚。(4)雖然有研究證明心梗后的炎癥可以影響心肌細胞的分化,但是具體的機制目前還不完全清楚。(5)目前雖有多種機制說明MSCs移植可以改善梗死心臟的功能,但到底是哪種/哪幾種機制占主要作用,還不完全清楚。但是我們相信,隨著有關方面研究的深入,以上問題均可以解決,MSCs必將成為治療心肌梗死的一項有效的臨床及實驗室治療手段。

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作者單位:350004 福建福州,福建醫科大學2005級研究生


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