摘要: 【摘要】 目的 探討外源性5-HT神經細胞移植對慢性不可預見性應激大鼠多內臟器官損傷的作用。方法 將40只雄性SD大鼠（購置第二軍醫大學實驗動物中心）隨機分為4組（10只/組）：正常對照組（Ⅰ）、慢性應激組（Ⅱ）、慢性應激細胞移植組（Ⅲ）、慢性應激氟西汀治療組（Ⅳ）。采用慢性不可預見性應激抑郁模型法造模后......
【摘要】 目的 探討外源性5-HT神經細胞移植對慢性不可預見性應激大鼠多內臟器官損傷的作用。方法 將40只雄性SD大鼠（購置第二軍醫大學實驗動物中心）隨機分為4組（10只/組）：正常對照組（Ⅰ）、慢性應激組（Ⅱ）、慢性應激細胞移植組（Ⅲ）、慢性應激氟西汀治療組（Ⅳ）。采用慢性不可預見性應激抑郁模型法造模后，將5-HT神經細胞1次性移植于Ⅲ組大鼠的蛛網膜下腔，Ⅳ組每天給藥1次3周；經Open-fie1d行為測試，解剖觀察、取材、切片，HE和免疫組化法等染色，鏡下觀察。結果 （1）與Ⅱ組相比，Ⅲ和Ⅳ組大鼠行為明顯改善；（2）大體解剖顯示：Ⅱ組大鼠肺出現灶狀充血，30％出現肺膿腫現象；Ⅲ組大鼠肺病變明顯減輕，未見肺膿腫發生；（3）HE和免疫組化染色：Ⅱ組大鼠出現胃腺萎縮，肺組織間炎癥細胞增多；Ⅲ和Ⅳ組大鼠胃腺和食管黏膜上皮萎縮以及肺組織炎癥反應減輕，5-HT免疫反應增強，陽性細胞數目增多，與Ⅱ組相比差異有顯著性（P<0.01）；Ⅲ組與Ⅰ、Ⅳ組相比差異無統計學意義（P>0.05）。結論 5-HT神經細胞移植對慢性不可預見性抑郁癥大鼠多器官損傷具有改善作用,其機制可能與移植細胞釋放5-HT，調節了中樞至周圍神經的膽堿能抗炎通路，并促進了周圍器官的5-HT合成有關。
【關鍵詞】 5-羥色氨； 細胞移植；抑郁癥；氟西汀
The effect and possible mechanisms with transplantation of 5-HT(hydroxytryptamine)cell for the multiorgan lesions on the rats by chronic unpredictable depression
WU Ai-qun，XU Jin-ming，ZHOU Qiang,et al.
Department of Human Anatomy, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China
【Abstract】 Objective To explore the effect and mechanisms with transplantation of serotonergic neurons on rats by chronic unpredictable stress. Methods 40 male rats (purchased from the experimental animal center of Second Military Medical University) were randomly divided into four groups: control group (Ⅰ), chronic stress group (Ⅱ), chronic stress model transplanted stress cells (Ⅲ), and chronic stress model treated with fluoxetine (Ⅳ). The model induced with the chronic unpredictable stress, Ⅲ group were transplanted the serotonergic cells once into the subarachnoid space of the rats, Ⅳgroup were administered once a day for 3 weeks; All animals of each group measured behaviorally, observed anatomically and analyzed statistically using HE and immunohistochemical method. Results （1）compared with Ⅱ group, the behaviour of the rats in Ⅲ and Ⅳ groups improved obviously；（2）the gross anatomy shown：the lungs of the rats in Ⅱ group appeared focal congestion, 30％ suffered from the pulmonary abscess；the lesions of the lung in Ⅲ group were reduced，none of them was found the pulmonary abscess;（3）HE and immunohistochemical staining : the gastric gland cell presented atrophy and a numbers of the inflammatory cell presented in the pulmonary tissue of group Ⅱ; the atrophy of the gastric gland cell and esophageal mucous membrane and the inflammation of the lung in the group Ⅲ and Ⅳ were slighter; 5-HT immunohistochemical reaction heightened and the number of the positive cells was more in the group Ⅲ and Ⅳ than in group Ⅱ（P<0.01）. But there was no significant differences on the lesion degree of their organs between Ⅲ and Ⅰ,Ⅳ（P>0.05）. Conclusion The transplantation of serotonergic neurons plays a improving role on lesion of many organ in the rats by chronic unpredictable stress, the mechanism may be related to the transplantation of the serotonergic neurons coordinating the central nervous pathways and promoting 5-HT synthesis of the relevant cells in the ambient organs.
【Key words】serotonin; cell transplantation; depression; fluoxetine
慢性應激可導致機體不同程度的傷害與許多器官的疾病［1］，但其發病機制尚不十分清楚，有關病因學主要認為心理社會因素和遺傳因素，長期作用于中樞神經而使神經通路失調和下丘腦-垂體-內分泌軸調節紊亂（腎上腺軸功能亢進）所致。許多研究資料報道［2，3］，抑郁癥神經遞質的異常主要表現為腦的5-羥色胺（5-HT）合成減少，病理尸檢的腦組織內（腦干和額葉）5-HT含量降低以及海馬5-HT受體總量減少。解剖學研究顯示5-HT細胞較多分布于胃腸的嗜鉻細胞（90%）和腦干中縫核（2%），中縫核的上、下行纖維廣泛投射到腦和脊髓。生理學研究證實中縫核、下丘腦、海馬等處的5-HT神經元和纖維與睡眠、情緒和行為調節有關。臨床應用5-HT再攝取抑制劑氟西汀治療或提高腦內5-HT水平治療抑郁癥有效，動物實驗表明氟西汀可使5-HT受體表達增多［4～6］，提示采用延長或增強5-HT作用的方法可能獲得防治抑郁癥或慢性應激損傷的效果。為此，本文采用國際公認的慢性不可預見抑郁癥模型和5-HT細胞移植的方法，研究了5-HT神經元移植對慢性應激所致抑郁癥與多器官損傷的影響，為進一步闡明抑郁癥的發病機制，并為臨床防治抑郁癥開辟新的治療途徑提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 動物與分組
成年雄性SD大鼠，體重120～140g，由上海第二軍醫大學動物中心提供，經Open-field法行為學評分，選擇評分相近的40只動物，隨機分為4組（n＝10 /組）：正常對照組（Ⅰ）、抑郁模型組（Ⅱ）、抑郁模型細胞移植組（Ⅲ）、抑郁模型氟西汀治療組（Ⅳ）。以慢性不可預見性抑郁模型法造模后，對照組動物5只/籠，應激組1只/籠，自由飲食,光/暗周期為12h/12h(光照時間6:00～18:00),背景噪音為（40±10）分貝,溫度為（20±3）℃。
1.2 慢性不可預見性抑郁癥動物模型的建立［7，8］
抑郁癥模型鼠接受21天不同的應激:電擊足底(1.0mA，每次10ks，間隔1min刺激1次，共30次)；禁食24h；4℃冷水游泳5min；休息24h；45℃熱應激5min；搖晃1次/s，15min；晝夜顛倒24h，夾尾1min。分別在試驗前1天和試驗開始后第7、14和21天，觀測其行為變化。
1．3 5-HT細胞移植與氟西汀給藥
取培養14天的胎鼠腦橋和中腦中縫區5-HT神經細胞離心后，將細胞濃度調整為5×107個/ml；每只模型鼠在麻醉下，固定為俯臥位，自腰背部打開椎管，用微量注射器穿硬脊膜行蛛網膜下腔注入細胞懸液5μl（對照組同方法注入5μl生理鹽水），檢查術區無出血，逐層縫合關閉切口，放回籠內飼養。抑郁癥動物模型制模結束后,次日開始每天在規定時間內腹腔注射鹽酸氟西汀,劑量為2mg/（kg·d）×14d。
1．4 行為活動測定（Open-field test）
分別在第0、7、14和22天，將試驗動物置于高50cm，直徑80cm，底壁等分標界的圓柱形敞箱內，光照度約60Lux，室內隔音，記錄動物行為，每次測定時間3min。以穿越底壁塊數為水平活動（Crossing）得分，直立次數為垂直活動（Rearing）得分。同時，測定動物理毛時間(Grooming Time），等待時間（Waiting Time）即動物從進入敞箱到開始活動的時間，每只動物僅進行一次行為測定。
1．5 動物處理
（1）40mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開胸，經左心室升主動脈插管，剪開右心房，先灌注生理鹽水 250ml，繼以灌流4%多聚甲醛150ml，持續30min。（2）各組胸腹部大體解剖觀察食管、胃和肺，于相同部位的組織取材，4％多聚甲醛后固定6～12h，石蠟包埋、切片，片厚6μm。
1．6 染色與觀察
將切片經3%的正常山羊血清和0.3%的Triton X-100 PBS孵育40min，然后直接加入稀釋成1:500的5-HT抗體(BD生物公司)，4℃過夜，再加入二抗孵育液（1：200）37℃ 2h, DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。
1．7 統計學處理
實驗數據采用圖像分析，以算術平均數±標準差（x±s）表示，使用SPSS（10.0）統計軟件對數據首先進行正態檢驗，然后進行t檢驗（或單因素方差分析，方差不齊進行變量轉換），以α＝0.05為檢驗水準。
2 結果
2．1 抑郁模型鼠體重和行為變化
以后3天的結果作比較，Ⅱ組大鼠行為學變化與Ⅰ組相比, 水平活動和垂直活動次數、理毛時間均明顯下降，等待時間顯著延長（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ組與Ⅱ組相比，水平活動和垂直活動次數、理毛時間均增加，等待時間顯著縮短，差異有顯著性（P<0.05）。Ⅱ組大鼠體重增加量與Ⅰ組相比顯著減少（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ組大鼠體重增加量較Ⅱ組明顯增多，差異均有顯著性（P<0.05）。而Ⅲ組大鼠行為學和體重變化與Ⅰ、Ⅳ組相比，無統計學意義（P>0.05）（見表1）。表1 慢性應激與細胞移植后大鼠敞箱行為的比較（略）注：Ⅰ組與Ⅱ組，或Ⅱ組與Ⅲ、Ⅳ組相比，P＜0.05；Ⅰ組與Ⅲ、Ⅳ組相比， P>0.05
2．2 抑郁模型鼠大體解剖
Ⅱ、Ⅲ組與Ⅰ組相比，大鼠食管較細，胃較小，壁薄，Ⅲ組較Ⅱ組者明顯改觀，Ⅲ與Ⅳ組差別不明顯；Ⅱ組肺胸肋面色澤不均，可見灶狀充血，25%大鼠的肺出現結節狀或大葉狀膿腫；Ⅲ、Ⅳ組與Ⅱ組相比，肺表面形態有明顯改善。
2．3 HE和免疫組化染色
與Ⅰ組相比，Ⅱ組肺組織間炎癥細胞增多或明顯聚集，Ⅲ、Ⅳ組大鼠肺組織炎癥細胞明顯減少；Ⅱ組大鼠食管黏膜層變薄，胃底腺細胞變小，腺體變窄，呈現萎縮狀；Ⅲ、Ⅳ組萎縮不明顯。5-HT細胞免疫陽性反應呈棕黃色。Ⅱ組與Ⅰ組相比，大鼠肺泡壁細胞、食管黏膜層細胞顯色變淺（圖1，圖2）；各組大鼠胃底腺5-HT陽性細胞分別為（96.26±13.22）%、（36.35±18.26）%、（93.18±16.12）%、（92.21±19.13）%，Ⅱ組較Ⅰ組胃底腺5-HT陽性細胞明顯減少，Ⅲ、Ⅳ組與Ⅱ組相比，5-HT陽性細胞數目增多，差異有顯著性（P<0.01），且著色加深（圖3）；Ⅲ、Ⅳ組與Ⅰ組相比差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
3.1 5-HT神經元移植對抑郁模型鼠體重和行為變化的影響
我們制作的慢性不可預見性應激大鼠表現為多項行為異常［9］，以及其額葉皮層和海馬結構的器質性改變，如神經元尼氏體脫顆粒，退行性變，部分細胞丟失，表明了模型的成功建立。有關其發病機制普遍認為，下丘腦-垂體-內分泌軸調節紊亂（腎上腺軸功能亢進）、生化代謝障礙［10］、腦的5-羥色胺（5-HT）含量降低以及海馬5-HT受體總量減少等反應所致［6］。不少實驗證明應用5-HT在攝取抑制劑氟西汀可改善抑郁癥動物的病理癥狀［6］。本試驗發現， 5-HT神經細胞-蛛網膜下腔移植后可使抑郁癥大鼠的水平活動和垂直活動次數、理毛時間增加，等待時間顯著縮短，與非治療組相比差異有顯著性（P＜0.05）。結果表明5-HT神經細胞-蛛網膜下腔移植具有改善抑郁癥大鼠異常行為的作用，可產生與氟西汀相似的效應。分析其作用機制可能與移植的細胞分泌和提高了腦脊液內5-HT濃度，調節了紊亂的中樞神經通路有關。
3.2 5-HT神經元移植對抑郁模型鼠多器官損傷的影響
早有研究發現應激可引起胃潰瘍等，近來還有臨床分析報道內臟腫瘤亦與精神抑郁有關［11］。我們的實驗顯示，慢性不可預見性應激抑郁模型鼠則出現食管和胃壁黏膜萎縮，肺灶狀充血，或肺膿腫；鏡下可見胃黏膜腺體變窄；肺間質炎癥細胞增多，或灶狀，或大片膿細胞聚集。結果表明長期慢性不可預見性應激亦可誘發胃萎縮、肺間質炎癥和肺膿腫等多器官損傷。5-HT神經細胞-蛛網膜下腔移植的抑郁癥大鼠，其胃萎縮和肺間質炎癥減輕，與非治療組相比差異有顯著性（P＜0.05），結果較氟西汀作用較好，但無統計學意義（P>0.05）。由此表明5-HT神經細胞移植具有減輕慢性應激引起多器官損傷的作用，對用于臨床治療抑郁癥具有潛在的可能性。
3.3 5-HT神經元移植減輕抑郁模型鼠多器官損傷的可能性機制
我們的實驗結果顯示，慢性應激大鼠已出現了中樞損傷（行為異常）、內臟損傷（食管、胃和肺出現病理改變）等多器官損傷的病理表現。根據神經解剖學證實的5-HT神經核由中樞至周圍內臟的神經通路：腦干中縫核（纖維）→腦干和脊髓的內臟神經核團（纖維）→迷走神經和交感神經→內臟，表明腦干5-HT神經調節著內臟的各種機能。近年來，神經-免疫的膽堿能抗炎通路（cholinergic antiinflammatory pathway）越來越受到國內外重視。有研究報道［12］, 抑郁癥患者外周血5- HT水平降低，其含量與愛丁保抑郁量表評價總分(PPDS) 呈顯著性負相關。干擾素治療常見的副作用是其可引起抑郁癥，聯合應用5-HT再攝取氟阻滯劑氟西汀可降低抑郁癥發病率［12，13］。國外有研究報道［14，15］，刺激迷走神經對內毒素引起的內臟損傷具有保護作用。由此表明，慢性應激引起的多器官損傷和細胞功能不足，可能與耗竭5-HT或損傷5-HT神經元的合成功能，最終使中樞與外周的5-HT減少，膽堿能抗炎功能不足，導致效應細胞的功能下降有關。
我們的研究還發現，5-HT細胞移植能產生對慢性應激的治療作用（慢性應激組的食管、胃和肺的病理改變明顯減輕）。結果表明5-HT神經元移植后減輕了應激性多器官損傷的病理變化。根據5-HT-迷走神經-膽堿能抗炎通路分析其作用機制，可能與移植的5-HT細胞經分泌5-HT調節了中樞至周圍的迷走神經通路，增強了膽堿能抗炎通路的保護作用有關，即通過移植細胞的分泌作用，不同程度地糾正了內臟核團的功能失常，進而增強了迷走神經-膽堿能通路的抗炎作用，并改善了外周的5-HT細胞功能，減輕了應激性器官的損傷等，但其確切作用機制尚需進一步研究。
作者單位：1 200433 上海，第二軍醫大學解剖學教研室 2 200433 上海，第二軍醫大學長海醫院神經內科
