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MAPK途徑在大鼠肝干細胞增殖調控中的作用

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:姚鵬, 胡大榮 2008-7-4

摘要: 【摘要】 目的 探討ERK1/2、p38-MAPK、PI3K/AKT等信號途徑在HGF介導的肝干細胞增殖信號中的作用及其信號轉導途徑之間的相互聯系和作用機制。方法 通過western blotting 檢測ERK、 p38MAPK、Akt 信號分子及磷酸化蛋白的表達。結果 在WB細胞,HGF確實能夠激活ERK、 p38MAPK、 PI3K/AKT途徑。ERK途徑在HGF刺激 5min......


【摘要】  目的 探討ERK1/2、p38-MAPK、PI3K/AKT等信號途徑在HGF介導的肝干細胞增殖信號中的作用及其信號轉導途徑之間的相互聯系和作用機制。方法 通過western blotting 檢測ERK、 p38MAPK、Akt 信號分子及磷酸化蛋白的表達;通過3H-TdR摻入DNA的方法來檢測細胞的增殖細胞。結果 在WB細胞,HGF確實能夠激活ERK、 p38MAPK、 PI3K/AKT途徑。ERK途徑在HGF刺激 5min后發生磷酸化,并且完全磷酸化發生在HGF作用15min,1h后逐漸消失。 Akt 也在HGF作用5min后發生磷酸化,15min后達到完全磷酸化并且持續至少2h。 P38 MAPK 途徑也在 5min后開始激活,在 30min后逐漸減少,持續大約3h;我們還發現, 用MAPK抑制劑 U0126, SB23580 處理后能夠明顯減低HGF誘導的增殖效應, 但是用Ly294002處理阻斷PI3K/AKT途徑后則并不影響HGF誘導的增殖效應。表明,ERK1/2、p38MAPK 途徑的激活參與HGF介導的細胞增殖效應,而PI3K/AKT途徑則并不參與HGF介導的細胞增殖調控。結論 在WB細胞,HGF能夠激活ERK、 p38MAPK、 PI3K/Akt等信號途徑。ERK1/2 和 p38MAPK 途徑的激活參與HGF介導的細胞增殖效應,而PI3K/AKT途徑則并不參與HGF介導的細胞增殖調控。

【關鍵詞】  肝干細胞; 細胞因子; 信號轉導


     Role of MAPK pathways in stem hepatocyte control and regulation for its, proliferation effect

    YAO Peng,HU Da-rong.Institute of Liver Disease, PLA 100700,China

    【Abstract】  Objective  To study the role of MAPK and PI3K pathways in hepatocyte growth factor-mediated proliferation effect on WB F-344 cell.  Methods  To determine effect of HGF on ERK, P38 MAPK,  and AKT phosphorylation. Cells were treated or not treated with the specific inhibitors before HGF (40 ng/ml) stimulation,  than the phosphorylation of ERK,  p38MAPK, Akt following HGF stimulation were analyzed by Western blotting;  To determine which pathway involved in HGF induced proliferation activity,  proliferation activity were analyzed by [3H] thymidine incorporation.  Results  The ERK,  p38MAPK, Akt pathways were activated by HGF, and involved in mediating cellular proliferation.  The proliferation effects of HGF were inhibited when MAPK pathway was abolished by the specific inhibitor U0126, but not inhibited when PI3K/AKT pathway was abolished by inhibitor Ly294002. It suggest that ERK, p38MAPK pathways are involved in  HGF-induced proliferation in WB cells. But  PI3K/AKT pathways are not involved in HGF-induced proliferation.  Conclusion  HGF activated ERK, P38 MAPK, and PI3K/AKT pathways; ERK, p38MAPK pathways are involved in  HGF-induced proliferation in WB cells. But  PI3K/AKT pathways are not involved in HGF-induced proliferation.

    【Key words】  hepatic stem cells; cell factor;signal conduction

    MAPK是一族胞漿內廣泛分布的蛋白激酶,包括細胞外調節蛋白激酶(Extracellular-signal Regulated Kinase, ERK)、P38-MAPK、c-JUN N端激酶(JNK)。在細胞的增殖、分化和生存中起著重要作用[1,2] ,多種增殖和抗凋亡信號通過MAPK的激活進行調控。它們參與細胞對各種信號的調節,觸發級聯性活化,在不同的時間將信號傳導至不同的區域,產生如增殖、分化或凋亡等多種生物效應。

    HGF是一種具有多種生物功能的細胞生存調節因子,能夠介導細胞的增殖、離散及抗凋亡作用[1,2]。HGF的信號轉導是通過其受體C-met的酪氨酸磷酸化而激發,HGF作用于c-met的β-亞單位C末端多功能位點,導致C-met和一些胞漿信號蛋白的相互作用,依次激活MAPK和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)等信號途徑[3,4]。在大鼠肝干細胞系WB F344細胞,HGF能夠誘導明顯的細胞增殖,然而HGF/met介導的信號系統在肝干細胞的傳導機制還不十分清楚。

    HGF誘導的肝干細胞的增殖作用是否也通過MAPK途徑?這些信號途徑如何參與肝干細胞的增殖調控?為此,我們的研究將探討MAPK信號途徑在HGF介導的信號轉導中的調控。

    1  材料與方法

    1.1  主要試劑   肝細胞生長因子Hepatocytes Growth Factor(HGF),  購自 Sigma. 不同信號途徑的特異抑制劑均購自Promega 溶于 DMSO。 ERK 特異抑制劑U0126、 PI3K特異抑制劑Ly294002、 所用濃度均為 20μM。 p38 MAPK 特異抑制劑 SB 203580,所用濃度為15μM;ERK、p38MAPK,辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體,ECL檢測系統均為Santa Cruz 產品 。

    DMEM為Gibco公司產品,胎牛血清為Life Technologies 公司產品,胰酶為Gibco公司產品, PMSF為Sigma公司產品, PVDF膜為Amersham公司產品。

    1.2  主要儀器及設備  細胞培養箱:Heraeus;超凈工作臺:北京半導體設備一廠; 倒置顯微鏡:重慶光學儀器廠XDS-1;液閃儀:蛋白電泳儀及電轉移裝置:BIO-RAD 美國;成像儀:Stratagen Eagleeye II: 美國;可見/紫外分光光度儀:Beckman;PM-30自動照相系統:Olympus; Kodak Scientific Imaging Systems  軟件分析系統。

    1.3  細胞培養  大鼠WB-F344肝干細胞系,我所提供。

    1.4  3H-TdR摻入DNA的方法來檢測細胞的增殖細胞  細胞用胰酶消化,稀釋細胞密度至50000細胞/ml,按每孔100μl接種于96孔細胞培養板,37℃5%CO2下培養24h,在含0.5%血清的培養液中饑餓24h, WB細胞用或不用各種特異的抑制劑(U0126 20 M;SB203580 15μM; Ly294002 20μM)預處理,然后加入HGF(40ng/ml)刺激24h, 每孔加入1.85×104Bq3H-TdR, 3h后收集細胞,以液閃計數表示刺激活性。

    1.5  Western Blotting

    1.5.1  細胞蛋白提取  WB細胞在含0.5%血清的培養液中饑餓12h,然后用HGF(40ng/ml)刺激不同時間(0、5、15、30、60、120min),收集細胞,用冰冷的PBS洗細胞3次,加入600μl RIPA裂解液(2×106 細胞), 置于冰上作用30min, 用細胞刮取器刮下細胞, 4℃離心15000g離心,30min,上清即為總的細胞蛋白溶解成分。

    1.5.2  比色法測定蛋白質濃度  分別在5ml離心管中加入0.2mg/ml牛血清白蛋白0、 50、 100、 200、 300、 400、 500, 以去離子水補足至500μl, 各管加入5ml考馬斯亮藍染色液,振蕩混勻,測定A595, 取A595吸光值對標準蛋白濃度作圖;測定待測樣品的A595,從BSA標準曲線中確定其蛋白濃度。30μg 蛋白等量上樣。

    1.5.3  蛋白印跡  按常規方法進行SDS-PAGE,分離膠為10%;100轉膜(經甲醇處理的PVDF膜),封閉1h, 用TBS-T洗一次5min, 置于兔抗鼠一抗 (用封閉液1:2000稀釋)中,搖床上緩慢搖動1h,簡單地在TBS-T中漂洗2次,用TBS-T洗4次,每次10min,置于辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗 (用封閉液1:5000稀釋)中,   搖床上緩慢搖動1h,簡單地在TBS-T中漂洗2次,用TBS-T洗4次,每次10min。用ECL系統進行檢測,將A液與B液等體積混合,配成發光劑,均勻地涂在PVDF膜上,1min后吸去發光劑,用保鮮膜將PVDF膜包裹,X線片壓片,曝光20s~5min, 顯影2min,定影5min。

    2  結果

    2.1  細胞因子對肝干細胞增殖的影響  我們用不同的細胞因子,以不同的濃度對WB細胞進行作用,24h后,用H3-TDR摻入法檢測細胞因子對WB細胞體外生長的影響。發現,HGF對WB-F344細胞具有促進增殖作用,并具有劑量效應正相關(見圖1)。注:縱坐標為H3-TDR摻入CPM值;橫坐標為細胞因子劑量

    2.2  HGF 刺激WB細胞信號轉導途徑的激活   ERK、 p38MAPK、 PI3K/Akt等信號途徑可以被多種細胞生長因子激活, 參與介導細胞增殖、離散、抗凋亡及分化。在肝干細胞,HGF是否激活這些信號轉導途徑,從而參與細胞調控?為此我們將WB 細胞在含0.5%血清的培養液中饑餓 12h, 然后用 HGF (40ng/ml)刺激不同時間(0、5、15、30、60、120min),通過western blotting 檢測 ERK、 p38MAPK、 Akt 信號分子及磷酸化ERK、 p38MAPK、 Akt(P-ERK,P-p38MAPK, P-Akt)。結果顯示(見圖2), 在WB細胞,HGF確實能夠激活ERK、 p38MAPK、 PI3K/Akt途徑。ERK 途徑在HGF刺激 5min后發生磷酸化,并且完全磷酸化發生在HGF作用15min,1h后逐漸消失。 Akt作為PI3K的下游靶蛋白是一種多功能調節因子,參與細胞生存和凋亡的調控。 Akt 也在HGF作用5min后發生磷酸化, 15min后達到完全磷酸化并且持續至少2h。 P38 MAPK 途徑也在 5min后開始激活,在 30min后逐漸減少,持續大約 3h。

    2.3  MAPK信號途徑在肝干細胞增殖調控中的作用  為明確MAPK途徑在HGF介導的WB F-344細胞增殖中的作用,我們用特異的抑制劑(U0126 20M;SB203580 15 M)預處理WB細胞,分別阻斷不同的信號途徑,再用HGF(40ng/ml)刺激,24h后用H3摻入法檢測細胞的增殖效應,發現用U0126、 SB203580 處理后能夠明顯減低HGF誘導的增殖效應,表明, ERK1/2和p38MAPK 途徑的激活參與HGF介導的細胞增殖效應(見圖3)。

   3  討論

    細胞對于外界刺激的反應是通過信號之間的相互作用和交流進行的。當不同的信號進入細胞,細胞必須對多種信號進行平衡調節,最終作出一種適當的反應,如增殖、分化、生存或凋亡。蛋白激酶系列是細胞信號轉導的重要介質,外界信號刺激后,可以觸發多種蛋白激酶的級聯活化,與各種信號相適應,傳遞并能夠放大信號,從而在不同的時間將信號傳導至不同的區域,維持不同的時間,并且產生多種及適當的反應方式[5,6]。

    MAPK是一族胞漿內廣泛分布的含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶。哺乳動物的MAPK家族包括ERK、JNK、P38-MAPK,由它們構建了幾條基本的MAPK信號轉導途徑:(1)Ras/ERK通路;(2)JNK/SAPK通路;(3)P38-MAPK通路。MAPK途徑,是將細胞外刺激信號傳遞到細胞核,介導細胞產生反應的細胞信息傳遞的重要通路, MAPK介導細胞生長、分裂、凋亡以及細胞間功能等多種細胞生理過程[7]  。在生長因子及環境應激的作用下,絲裂原激活蛋白激酶被激活后可以調節DNA的復制與基因的表達。

    研究表明MAPK的激活可能對決定細胞的命運起重要作用,比如細胞的生存、分化和凋亡[8]。炎性因子TNFα及各種刺激誘導的JNK和(或)P38途徑的早期短暫激活和晚期持續激活分別與細胞的生存、分化及凋亡相關。

    在我們的研討中發現,HGF可以激活ERK、 p38MAPK 途徑, ERK 途徑在HGF刺激 5min后活化, 在15min時發生完全磷酸化,1h后逐漸消失。P38 MAPK 途徑也在 5min后發生磷酸化激活,在 30min達到高峰,持續大約 3h。 我們進一步用U0126,SB203580特異地阻斷ERK及p38-MAPK途徑,再觀察HGF介導的增殖作用。發現,U0126,SB203580處理后能夠明顯減低HGF誘導的增殖效應,表明,ERK1/2 and p38MAPK 途徑的激活參與了HGF介導的WB細胞的增殖調控。

    總之,這些結果表明,在WBF-344細胞,HGF可以激活ERK、p38MAPK途徑;ERK、p38MAPK途徑參與HGF介導的WB 細胞在增殖調控;由于ERK、p38MAPK途徑介導的信號轉導過程直接調節細胞的多種生理生化功能[9,10],因而,在體內信號網絡中的作用十分復雜,與細胞內多條信號轉導通路有著密切的聯系,這些信號間的復雜關系及相互作用機制還需進一步研究。

  

【參考文獻】
  1 Bliska JB. Yersinia inhibits host signaling by acetylating MAPK kinases. ACS Chem Biol,2006,1(6):349-351.

2 Wang Z, Yang H, Tachado SD,et al. Phosphatase-mediated crosstalk control of ERK and p38 MAPK signaling in corneal epithelial cells.Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006,47(12):5267-5275.

3 Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF. Met receptor tyrosine kinase: enhanced signaling to the adapter proteins. Oncogene, 2000,19:5582-5589.

4 Shaharabany M, Abramovitch R, Kushnir T, et al. In vivo molecular imaging of met tyrosine kinase growth factor rqceptor activity in normal organs and breast tumors. Cancer Res, 2001, 61:4873-4878.

5 Kong AN, Yu R, Chen C, et al. Signal transduction events elicited by natural products: role of MAPK and caspase pathways in homeostatic response and induction of apoptosis Arch Pharm Res, 2000,23(1):1-16.

6 Jo M, Stolz DB, Esplen JE,et al. Cross-talk between epidermal growth factor receptor c-Met signal pathways in transformed cells. J Biol Chem, 2000,275:8806-8811.

7 Park JG, Yuk Y, Rhim H,et al. Role of p38 MAPK in the regulation of apoptosis signaling induced by TNF-alpha in differentiated PC12 cells. J Biochem Mol Biol, 2002, 35(3):267-272.

8 Yang GH, Jarvis BB, Chung YJ, et al. Apoptosis induction by the satratoxins and other trichothecene mycotoxins: relationship to ERK, p38 MAPK, and SAPK/JNK activation. Toxicol Appl Pharmacol, 2000, 164(2):149-160.

9 Wan X, Yokoyama Y, Shinohara A,et al. PTEN augments staurosporine-induced apoptosis in PTEN-null Ishikawa cells by downregulating PI3K/Akt signaling pathway. Cell Death Differ,2002,9(4):414-420.

10 Leist MF, Gantner H, Naumann H,et al. Tumor necrosis factor-induced apoptosis during the poisoning of mice with hepatotoxins. Gastroenterology,1997,112: 923-934.


作者單位:100700 北京,北京軍區總醫院肝病研究所


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