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快速成型技術在軟骨與骨組織工程中的應用研究

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:連芩, 李滌塵, 李愛民 王玨 2008-7-4

摘要: 【摘要】 目的 總結國內外軟骨與骨組織工程中快速成型工藝方法及其研究進展。方法 檢索Elsevier和Emerald數據庫中1997-01/2007-02及CHKD期刊全文數據庫相關軟骨與骨復合體的快速成型制造方法的文獻,檢索詞“rapid prototyping, Osteochondral tissue engineering, osteochondral construct”等。對資料進行初選,......


【摘要】  目的 總結國內外軟骨與骨組織工程中快速成型工藝方法及其研究進展。方法 檢索Elsevier和Emerald數據庫中1997-01/2007-02及CHKD期刊全文數據庫相關軟骨與骨復合體的快速成型制造方法的文獻,檢索詞“rapid prototyping, Osteochondral tissue engineering, osteochondral construct”等。對資料進行初選,納入標準:(1)軟骨與骨組織工程的發展現狀;(2)軟骨與骨復合支架的結構設計與制造方法;(3)快速成型軟骨與骨組織工程支架的制造方法。粗選數百篇相關文章,根據納入標準確定68篇,最后分析27篇。結果 快速成型技術為人工支架復雜結構的設計制造提供了新的理念和技術手段,是組織工程的一個重要研究方向。目前應用于軟骨與骨組織工程的快速成型工藝主要有三維印刷、熔化沉積和選區激光燒結等。結論 基于軟骨與骨組織微觀結構圖像,并結合現代CAD/CAE和RP技術來設計和制造的軟骨與骨復合支架,正在成為軟骨與骨組織工程研究的一個新熱點。

【關鍵詞】  快速成型技術;軟骨與骨組織工程;人工支架;生物可降解性


    關節上軟骨與骨的良好結合保證著關節的穩定性和運動功能,但是因創傷和關節炎等疾病引起的關節軟骨缺損,則會造成關節功能障礙甚至殘疾。然而由于對其的生理性修復需要涉及軟骨和骨兩種不同的組織修復,使得關節軟骨缺損修復成為醫學上的一個難題。目前利用軟骨細胞修復軟骨缺損已經獲得較好的治療效果,現代軟骨與骨組織工程進一步提出構建具有復雜結構或成分的可降解性生物材料人工支架,然后將細胞與支架復合后進行關節缺損修復,但軟骨與骨復合支架的設計和制造卻是研究的難點。

    快速成型(Rapid Prototyping, RP)技術,又稱自由實體制造(Solid Freeform Fabrication, SFF),自20世紀80年代中期產生以來獲得迅速的發展,目前已經發展并形成20多種工藝,其中比較成熟的工藝方法有光固化原型、選擇激光燒結、分層實體制造、三維印刷、熔化沉積等。快速成型技術具有由數字驅動直接累積材料形成三維實體,不受形狀復雜程度限制,并且在制造過程中可隨時改變和控制材料成分等特點,目前結合反求/CAD/CAE和RP技術為軟骨與骨復合體的制造提供了新的理念和技術手段,并正在形成軟骨與骨組織工程的一個研究熱點。本文將主要介紹應用于軟骨與骨組織工程的幾種快速成型工藝及其原理,以及相關的國內外研究現狀。

    1  軟骨與骨復合支架的快速成型工藝流程

    基于RP的人工支架的制造方法可以分為直接成型制造和間接制造兩類。直接成型制造是利用快速成型工藝直接累積加工可降解性生物材料獲得支架,其典型工藝流程如圖1所示。間接制造是先利用快速成型技術制造支架負型,再填充生物材料后經過高溫燒結等方法去除負型材料獲得支架。

    2  軟骨與骨復合支架的快速成型工藝

    目前應用于軟骨與骨組織工程的快速成型工藝主要有三維印刷、熔化沉積、選區激光燒結、光固化原型等方法。以下以各成型工藝分類介紹。

    2.1  三維印刷(Three-Dimensional Printing, 3D-P)  3D-P工藝原理為:利用噴射黏結劑的噴頭加工粉末材料。噴頭在計算機指令下,給每一層平鋪于工作臺粉末材料選擇性地噴射黏結劑,被噴上黏結劑的粉末相互粘結,并層層累積,最終形成三維實體,然后去除粉末,經過燒結等后處理獲得零件實體。

    美國密歇根州立大學Hollister等[2,3]利用SolidScope○R三維印刷技術制造蠟或PSA支架負型模具,填充HA漿體后經燒結工藝去除有機質,可形成復雜結構的HA多孔支架,然后將PLA澆鑄在HA支架上形成PLA/HA雙層支架。其PLA部分孔徑為600μm,HA孔徑為500μm。Schek等[4]在此基礎上,制造PLA/HA雙層軟骨與骨復合支架,以PLA為軟骨端,以HA為骨端,并在PLA和HA材料之間沉積一個PGA薄層,以防止細胞在軟骨與骨區之間的遷移。然后,在該支架的HA骨端種植帶有BMP-7的纖維原細胞(利用腺病毒轉導),在PLA軟骨端種植軟骨細胞。將其埋置在小鼠皮下的研究發現,PLA/HA支架可在異位同時促進骨和軟骨生長,并形成礦化界面組織;而且在支架的HA骨端,新生的組織內部有血管和骨髓樣基質等生成。

    美國Sherwood等[5]以TheriForm○R三維印刷技術直接制造兩種支架,第一種為孔隙率為25%~55%的L-PLGA/TCP (成分質量比85:15)支架,對其力學性能測試顯示出孔隙率增大將明顯降低其抗拉壓強度和彈性模量。第二種支架為孔隙率90%的L-PLGA/L-PLA(成分質量比50:50)支架,對其進行的體外培養實驗反映出軟骨細胞可快速進入支架內部,具有良好的軟骨細胞吸附能力和成軟骨能力。在此基礎上構建軟骨與骨的雙層支架:骨端支架材料為L-PLGA/TCP,孔隙率為55%,孔徑為125~150μm;軟骨端支架材料為L-PLGA/L-PLA,孔隙率為90%,孔徑106~150μm。由于在制造過程中,粉末的成分和每層的圖案可以按照設計要求改變,形成的支架在骨端與軟骨端之間的界面區將形成梯度變化的材料成分和孔隙率,可以避免支架在體外培養和體內植入后出現界面分離的現象。

    2.2  選區激光燒結(Selected Laser Sinter, SLS)  SLS工藝原理為:利用CO2激光器發射激光束,將粉末材料逐層固化形成三維實體。即在計算機指令的控制下,激光束有選擇地燒結工作臺上平鋪的一層粉末,被燒結的粉末固化,而未被燒結的材料仍為粉末。待第一層燒好后,工作臺帶著第一層下降一定高度,再鋪上第二層粉末,并用輥子鋪平,重復燒結過程,并使相鄰層牢固地燒結在一起。重復上述過程,逐層燒結,每層都與上層黏結在一起,最終去掉未被燒結的粉末形成零件實體。

    新加坡南洋理工大學Leong等人[6,7]采用SinterStation2500直接成型具有各種骨骼形狀的PEEK、PEEK/HA、PVA、PCL、PLLA等多孔支架。美國Lee等人[8,9]采用PMMA作為黏接劑,與多種磷酸鈣鹽粉末混合,應用SinterStation2000(DTM Corp, Austin, TX, USA)成型支架原型,再經過燒結等后處理過程去除有機質形成HA多孔支架。通過對密度為1.4g/cm3,孔隙率為30%的支架的力學性能分析,其壓縮強度為18.6MPa。通過兔、狗動物骨缺損修復研究,發現其具有良好的生物相容性和可吸收性,支架與原骨結合良好并在缺損區形成骨連接;4個月時支架內部孔隙內充滿成熟骨組織,支架多孔結構內顯示出明顯的骨浸潤現象。

    2.3  熔化沉積(Fused Deposition Modeling, FDM)  FDM工藝原理為:不采用激光器,而是利用加熱噴頭進行加工。絲材在噴頭中被加熱至略高于其熔點而成液態材料。在計算機指令下,噴頭可進行X-Y聯動和Z向運動。噴頭在X-Y二維運動中噴出熔融材料,快速冷卻并與隨后的熔融材料黏結在一起,每完成一個沉積層后,噴頭在Z向抬高,重復上述過程,最終層層累積形成零件實體。

    新加坡南洋理工大學Leong等[1,10]采用FDM1650system(Statasys Inc.)成型機,選擇HDPE線材和HA/HDPE制造具有完整骨骼外形的多孔支架。新加坡國立大學Hutmacher等[11~13]采用FDM技術制造PCL支架,在制造過程中,沉積層圖案不同,相互搭結,形成完全連通但孔隙率和孔道結構不同的支架結構特征。例如其制造的長方體PCL支架(32mm×25.5mm×13.5mm),孔隙率在(61±1)%,但因沉積層圖案構成不同,即形成的孔道結構不同,它們的抗壓強度分別為2.4MPa和20.2MPa。同時,他們還根據再生軟骨與骨組織對支架結構和力學性能的不同要求,提出在一個支架上劃分成骨區和軟骨區,在制造的過程中形成各區不同的孔道結構和孔隙率,然后在兩腔生物反應器中分別接種成骨細胞和軟骨細胞后共同培養構建骨軟骨復合修復體。

    美國華盛頓州立大學Bandyopadhyay等[14]采用FDM技術間接成型生物陶瓷支架,即首先以有機線材制造支架負型,然后填充β-TCP漿體經干燥和燒結形成多孔陶瓷支架。對其結構研究發現在燒結中會出現22%~45%的收縮率;對其在孔徑300~500μm和孔隙率25%~45%范圍的支架的體外細胞培養和力學性能研究發現,孔隙率是影響其支架力學性能和成骨細胞繁殖的關鍵參數,而其孔徑的影響并不明顯。

    西安交通大學與第四軍醫大學合作[15,16],采用FDM技術制造不同結構的CS支架負型,與自固化骨水泥復合后形成可控結構的CPC多孔支架。通過犬橈骨大段骨缺損修復實驗研究發現,支架顯示出明顯的成骨作用,并以軟骨化成骨為主。

    2.4  其他快速成型技術的應用研究  荷蘭Twente大學Woodfield等[17~19]利用三維沉積(3D fibre deposition)技術,即將PEGT/PBT顆粒在不銹鋼套內加熱成熔融狀態,加壓擠出成型PEGT/PBT支架,并可構建出完整的膝關節處股骨關節體和脛骨關節體。PEGT/PBT支架模量(equilibrium modulus)和剛度(dynamic stiffness)分別在0.05~2.5MPa和0.16~4.33 MPa范圍,具有與天然軟骨組織(模量0.27MPa,剛度4.10 MPa)近似的力學性能,將其植入裸鼠皮下28天的動物實驗發現具有明顯的成軟骨作用。

    清華大學與第四軍醫大學合作[20],采用TissForm低溫擠出成型機分別制造PLGA和PLGA/TCP支架,分別在PLGA支架上接種經軟骨誘導的兔BMSCs,PLGA/TCP支架上接種經成骨誘導的兔BMSCs構建組織工程軟骨和組織工程骨。將它們經體外培養2周后縫合形成軟骨與骨復合體,植入兔股部肌肉8周發現異位形成骨軟骨復合組織。西安交通大學與第四軍醫大學合作[21],采用SPS-600光固化成型機制造樹脂支架負型,填充CPC或β-TCP漿體,經燒結間接制造成CPC或β-TCP多孔支架,其內部具有完全連通和符合設計要求的仿生微管道結構,微管孔徑300~500μm,收縮率不超過2%,壓縮強度為5.8MPa。體外培養實驗證明其具有良好的生物相容性和促成骨作用。

    3  存在問題及研究方向

    可降解性多孔支架孔徑、孔隙率、連通孔徑等結構參數決定著支架的力學性能,支架的結構特征是細胞和再生組織性能的重要影響因素[22,23]。目前已經發現結構特征是生長因子的緩釋方式和影響生長因子對細胞三維并行生長作用的重要因素;孔徑變化引發間質細胞向軟骨細胞或骨細胞分化;支架孔道結構和孔隙率可造成再生復合組織形態和力學特征的差異性。因此,軟骨與骨復合支架的設計制造不僅需要考慮其材料的選擇,還需要考慮其結構的設計和可制造性。目前在軟骨與骨復合支架的研究上,已經提出制造其外形結構上近似骨骼生理結構,內部具有促進體液流動和細胞貼附的多孔或多管道連通結構,同時,多種材料的復合制造方法的興起,都使得軟骨與骨復合支架的材料的成分和結構的可控性和可制造性成為其重要的研究內容和研究難點。

    快速成型技術直接由數字驅動完成三維實體的制造,因此支架CAD模型的建立是支架設計和制造的關鍵問題。為了研究支架的計算機建模方法,需要進一步研究關節軟骨修復對軟骨與骨復合支架的結構要求。美國梅奧臨床醫學院[24]、新加坡國立大學[11]等利用組織學切片、microCT和MRI等圖像數據,結合反求/CAD技術建立組織復雜外形和內部微結構模型;美國紐約城市大學[25]等通過骨微結構內的流體壓力分布模型,發現微結構特征引發不同的流體動力學行為;加拿大Calgary大學[26]等利用有限元技術分析軟骨/骨植入體在缺損區的應力應變;美國Drexel大學[27]、新加坡國立大學[10]等構建類似松質骨結構和力學性能的支架結構;美國密歇根大學[3]等模擬設計單元中骨組織的再生過程,研究設計單元結構優化設計方法。國內西安交通大學與第四軍醫大學合作,結合骨組織結構特征數據的統計分析和反求/CAD技術,形成仿生骨支架模型。

    總之,采集自然軟骨與骨組織的微觀結構圖像,通過反求工程和CAD技術完成軟骨與骨復合支架的仿生結構建模,利用CAD/CAE技術對支架的力學特征、內部流體動力學特性及其軟骨與骨復合組織特征研究及支架的結構優化設計等研究,并利用RP技術完成支架復雜結構的制造的方案,正在成為軟骨與骨組織工程的一個新的研究方向和研究熱點。

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作者單位:1 710049 陜西西安,西安交通大學機械制造系統國家重點實驗室2 710049 陜西西安,西安交通大學生物醫學信息工程教育部重點實驗室3 710032 陜西西安,第四軍醫大學全軍骨科研究所


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