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三拗芎葶合劑對低氧性肺動脈高壓大鼠血清超氧化物歧化酶/丙二醛影響的實驗研究

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:楊仁旭1,盧小龍2,杜建霖2Δ,常生杰2,任 穎2Δ, 2008-7-4

摘要: 【摘要】 目的 觀察三拗芎葶合劑對HPH大鼠功能形態學及血中SOD和 MDA的影響,并探討其機制。方法 將50只雄性SD大鼠隨機分為5組:正常對照組、模型組、卡托普利組、三拗芎葶合劑中劑量組及三拗芎葶合劑大劑量組,每組10只。利用常壓缺氧方法復制大鼠低氧性肺動脈高壓模型,2周后灌胃相應藥物,連續用藥24天后,采用......


【摘要】  目的 觀察三拗芎葶合劑對HPH大鼠功能形態學及血中SOD和 MDA的影響,并探討其機制。方法 將50只雄性SD大鼠隨機分為5組:正常對照組、模型組、卡托普利組、三拗芎葶合劑中劑量組及三拗芎葶合劑大劑量組,每組10只。利用常壓缺氧方法復制大鼠低氧性肺動脈高壓模型,2周后灌胃相應藥物,連續用藥24天后,采用改良右心導管法測定肺血流動力學參數,比色法測定血清SOD水平與MDA含量;處死大鼠后,稱量wW、RV和LV+S,計算右心肥厚指數(RV/LV+S)及肺滲出指數(wW/BW);利用圖像分析方法,測定肺小動脈病理及其形態計量學。結果 (1)三拗芎葶合劑及卡托普利均能明顯降低模型大鼠mPAP、wW/BW、RV/LV+S(P<0.05和P<0.01),改善模型大鼠血流動力學指標,部分逆轉模型大鼠的肺血管重構;同時提高血清SOD活性水平,降低血清MDA含量(P<0.05和P<0.01),三拗芎葶合劑各劑量組與卡托普利組療效相當;但治療組上述各指標仍未完全恢復到正常對照組水平。結論 三拗芎葶合劑能提高血清SOD活性水平,降低血清MDA含量,能有效降低HPH模型大鼠的肺動脈高壓,部分逆轉肺血管結構重建,改善右心功能,其作用機制可能與清除自由基、抗脂質過氧化,保護EC,維持VSMC的正常舒張功能有關,提示該藥將是防治HPH的有效中藥復方制劑

【關鍵詞】  三拗芎葶合劑;低氧性肺動脈高壓;超氧化物歧化酶;丙二醛;肺血流動力學

    Experimental  research on the influence of Sanao Xiongting mixture on hypoxic pulmonary hypertension rats’ serum SOD/MDA
       
  YANG Ren-xu,LU Xiao-long,DU Jian-lin,et al.
  
  Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM   Chengdu,  Sichuan 610075,China
       
  【Abstract】  Objective  Observation the influence of Sanao Xiongting mixture on hypoxic pulmonary hypertension rats functional morphology and SOD/MDA in serum ,and discussing the mechanism. Methods   50 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups : normal control group, model group, captopril group, Sanao Xiongting mixture of mid- dose group and Sanao Xiongting mixture of high-dose group, 10 in each group. Using hypoxia induce pulmonary hypertension, two weeks later gavage corresponding drugs, after 24 days of continuous medication,using modified right heart catheterization to determine the pulmonary hemodynamic parameters, colorimetry was used to determine the serum levels of SOD and MDA; Rats were killed and weighed wW, RV and LV + S, calculated the index of right ventricular hypertrophy (RV / LV + S) and pulmonary exudative index (wW / BW); Using image analysis method to determine the pulmonary arterial pathology and morphometry. Results   (1) Sanao Xiongting mixture and captopril both could significantly reduce the rats’mPAP, wW / BW, RV / LV + S (P< 0.05 and P<0.01), improve rats’ index of hemodynamics, partly reverse the pulmonary vascular remodeling; meanwhile, raising the level of activity of serum SOD, reducing the level of MDA (P< 0.05 and P<0.01), Sanao Xiongting mixture group and the captopril group were considerable, however, the above indexes of the treatment groups do not fully restored to the normal control group. Conclusion  Sanao Xiongting mixture can increase  the serum level of SOD activity and lower the level of MDA,can effectively reduce the HPH rats’ pulmonary hypertension, partly reverse the lung vascular remodeling, improving the right ventricular function, its mechanism may be related to eliminate the free radicals, anti-lipid peroxidation, protecting EC, maintaining VSMC’s normal diastolic function, suggesting that this drug will be a effective herbal medication in combating HPH.
   
  【Key words】  Sanao Xiongting mixture;  hypoxic pulmonary hypertension(HPH); SOD;  MDA;pulmonary hemodynamics
                                        
  肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension,PAH) 屬于肺循環疾病中的一個重要類別。PAH由多種心、肺或肺血管本身疾病所引起,表現為肺循環的壓力和阻力增加,可導致右心負荷增大,右心功能不全,肺血流減少,而引起一系列臨床表現。目前廣泛采用的PAH血流動力學定義為:靜息狀態下肺動脈平均壓 >25mmHg,或運動狀態下>30 mmHg。而相應的肺毛細血管嵌壓<15mmHg。 PAH血流動力學分級,一般根據靜息狀態下肺動脈平均壓分輕度:26~35mmHg;中度:36~45mmHg;重度:>45mmHg三級。依據PAH的分類命名(2003,威尼斯)和2007年6月ACCP肺動脈高壓內科治療指南, 其中與肺疾病和低氧血癥相關的PAH有慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。所以低氧性肺動脈高壓動物模型被廣泛應用于研究該疾病的發生機制[1]。在COPD發生發展過程中,低氧作為導致PAH的重要因素,在初期表現為可逆的肺血管收縮,后期則表現為不可逆的肺動脈高壓及伴有肺血管重建的病理狀態。HPH則是COPD病理生理的關鍵環節,闡明其形成機制以及尋求理想的抑制HPH藥物一直是COPD、肺心病防治的重要研究課題[2]。肺動脈高壓屬于中醫“肺脹” 、“喘證”、“痰飲”范疇,其病機主要為:痰飲瘀血互結,肺失宣肅;治法宜為宣肺逐瘀化痰法;故擬用三拗芎葶合劑治療COPD、HPH取得較好療效, 在此基礎上進行三拗芎葶合劑對HPH大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)/丙二醛(MDA)水平 、 肺血流動力學、肺血管重構的影響,初步探討其作用機制。報告如下。
   
  1  材料與方法
   
  1.1  材料
   
  1.1.1  動物  健康成年雄性SD大鼠50只,體重192.3~237.8g,由四川省中醫研究院實驗動物中心提供[實驗動物合格證號:scxk (111)2004-15]。
   
  1.1.2  藥物  三拗芎葶合劑:由四川省中藥材公司提供合格藥材,經成都中醫藥大學附屬醫院藥劑加工廠煎煮、回收揮發性成分、濃縮,制成濃度為100%的藥液(每lml藥液含生藥1g)。卡托普利:安徽仁濟制藥有限公司,批號:20060412。
   
  1.1.3  主要試劑  MDA、SOD測定試劑盒:由南京建成生物工程研究所提供,批號:20040218。氮氣:四川拓展特種氣體有限責任公司提供。
   
  1.2  方法
   
  1.2.1  動物分組、大鼠HPH模型的建立[3.4]及給藥方法  (1)50只SD大鼠隨機分為5組:正常對照組、模型組、三拗芎葶合劑中、大劑量組及卡托普利組,每組10只,分籠飼養,自由飲水、攝食。(2)正常對照組不做處理,其余4組造模2周后,在每天進入低氧箱前1h分別灌胃生理鹽水、三拗芎葶合劑11 g/kg(相當于成人用量的10倍)、三拗芎葶合劑22g/kg(相當于成人用量的20倍)及0.1%卡托普利1mg/kg(相當于成人用量的20倍),各組所給藥液體積相同,每日1次,連續給藥至檢查前24h停藥。
   
  1.2.2  觀察、檢測項目及方法
   
  1.2.2.1  血流動力學指標  將大鼠以20%氨基甲酸乙酯 (1.6g/kg)腹腔麻醉后固定于手術臺上,用一充盈肝素溶液的聚乙烯管(外徑0.82mm)從分離的右頸外靜脈經上腔靜脈、右心房、右心室插管至肺動脈內,導管接壓力換能器,通過Gould3400多導生理記錄儀記錄RVSP、RVDP、PASP、PADP、mPAP(紙速為5mm/s)。
   
  1.2.2.2  血清MDA含量、SOD活性水平測定  自大鼠股靜脈處取混合靜脈血2ml,采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性, 用巴比妥酸法(TBA法)測定MDA含量, 應用紫外線分光光度計,比色法記取吸光度值(OD值), 測定SOD活性水平及MDA含量。
   
  1.2.2.3  心肺組織重量  采血完畢后,立即開胸,自左心室壁剪口,從右室壁向肺動脈內注入生理鹽水,灌洗肺內血液,分離肺臟,剪去肺門,以濾紙吸去表面水分,稱量肺濕重(wW);取出心臟,去掉血管、心房,游離右心室(RV),剩下左心室及室間隔(LV+S),冰鹽水洗凈血液,以濾紙吸去水分,分別稱量RV重和LV+S重,計算右心肥厚指數(RV/LV+S)及肺滲出指數(wW/BW)。
   
  1.2.2.4  肺組織病理形態學檢查  取同側肺組織(左側)后,立即用10%福爾馬林液固定1周,矢狀切面右肺門水平各取組織2塊,梯度酒精系列脫水,石蠟包埋,常規切片后行HE染色和彈力纖維染色,光學顯微鏡下觀察肺小動脈形態學改變。拍照后以Mias-2000病理圖像分析系統測量與終末細支氣管伴行的肺小動脈(直徑<300μm)管壁中膜厚度(MT)、外徑(ED)、管壁面積(MA)、管腔面積(VA)、血管總面積(AA);然后分別計算管壁中膜厚度與血管外徑比值(MT%)、管壁面積與血管總面積比值(MA%)和管腔面積與血管總面積比值(VA%),并計算出均值,作為大鼠的肺血管形態計量學指標進行統計分析。  
   
  1.2.2.5  統計學方法  采用SPSS11.5統計軟件包進行統計分析。數據用x±s表示,各組間均數比較采用單因素方差分析,兩兩比較采Student-Newman-Keulsg檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
   
  2  結果
   
  2.1  一般狀況觀察  模型組大鼠缺氧1周后,大鼠活動明顯減少,倦臥,喘息,食量減少,毛發直立、雜亂,鼻部及唇周紫紺;三拗芎葶合劑組大鼠精神轉好,毛發較前光整,呼吸漸趨平穩,活動增多。(注:模型組2只,三拗芎葶合劑中劑量組1只,卡托普利組1只大鼠經尸檢證實發生與實驗用藥無關的意外死亡。)
   
  2.2  肺血流動力學指標變化  本研究采用改良右心導管法直接測定肺血流動力學指標,各組大鼠肺血流動力學狀態對比見表1。                                                                                     
  表1  各組大鼠肺血流動力學狀態對比 (略)
               
  三拗芎葶合劑中劑量組與卡托普利組值無明顯差異(P>0.05);與模型組比較,三拗芎葶合劑各劑量組及卡托普利組的肺動脈壓力皆顯著降低(P<0.05和P<0.01),但各劑量治療組與正常對照組相比,值仍較高,未達到正常組水平(P<0.05和P<0.01)。表明三拗芎葶合劑能降低模型大鼠的肺動脈高壓。
   
  2.3  三拗芎葶合劑對血清MDA含量、SOD活性水平的影響  本次實驗結果顯示:與正常對照組相比,模型組大鼠血清SOD活性明顯下降,MDA含量明顯升高(P<0.01),而三拗芎葶合劑和卡托普利治療組肺組織中MDA含量明顯降低,SOD活性明顯增強。其結果見表2。
   
  表2  各組大鼠血清SOD、MDA水平比較   (略)
           
  2.4  肺組織重量  與模型組比較,三拗芎葶合劑各劑量組wW和wW/BW均明顯減輕 (P<0.05);三拗芎葶合劑各劑量組與卡托普利組比較無明顯差異(P>0.05)。各治療組與正常組相比,值仍較高(P<0.05)。其結果見表3。
    
  表3  各組大鼠wW、肺滲出指數比較  (略)
           
  2.5  心臟重量  與模型組比較,三拗芎葶合劑各劑量治療組及卡托普利組均明顯減輕,三拗芎葶合劑高劑量組與卡托普利組值相當(P>0.05);各劑量治療組與正常組相比,值仍較高。其結果見表4。   

  表4  各組大鼠右心肥厚指數、RV/BW比較  (略)
           
  2.6  病理形態學的變化  各組大鼠肺小動脈MT、MT%;MA%、VA%測定,結果見表5。
   
  表5  各組大鼠肺小動脈MT、MT%、MA%、VA%測定結果  (略)

  光鏡下,正常對照組大鼠肺小動脈管壁不增厚,內皮細胞扁平連續,細胞分布均勻,大小、厚薄較一致。模型組大鼠肺小動脈壁增厚,肺泡隔毛細血管擴張,間隔增寬,部分樣本有灶性肺萎縮、偶見支氣管炎。肺小動脈的中膜平滑肌明顯增生肥大,管腔明顯狹窄;肺血管損傷明顯,內皮細胞變性腫脹,突向血管腔內。三拗芎葶合劑各劑量組與卡托普利組大鼠肺小動脈管壁增厚程度及管腔狹窄程度顯著減輕,尤以卡托普利組效果明顯。
   
  結果顯示,模型組肺小動脈管壁增厚,管腔狹窄,三拗芎葶合劑和卡托普利在一定程度上可逆轉肺血管形態重建,以卡托普利組效果更好。
   
  3  討論
   
  低氧性肺動脈高壓的臨床表現及其發生、發展過程,當屬中醫“肺脹” 、“喘證” 、“痰飲”范疇。肺脹常繼發于肺咳、哮病等之后,因肺氣長期壅滯,肺恒久膨脹、不能斂降而脹廓充胸,以胸中脹悶,咳嗽咯痰,氣短而喘為主要表現的肺系疾病。  歷代中醫著作對本病病因病機乃至立法選方用藥均有較詳細的論述。如《靈樞·經脈篇》曰:“肺手太陰之脈……,是動則病肺脹滿,膨膨而喘咳”;《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證并治》曰:“上氣喘而躁者,屬肺脹”;“咳而上氣,此為肺脹,其人喘,目如脫狀,脈浮大者,越婢加半夏湯主之”;《醫學入門》:“肺脹滿,此痰與瘀血礙氣,所以動則喘息”。因此,我們概括HPH的基本病機是:痰瘀互結、肺失宣降,痰、瘀是其關鍵病理產物。治法為宣肺逐瘀化痰。三拗芎葶合劑由麻黃、杏仁、葶藶子、川芎等組成,共奏宣肺利水、降氣平喘、活血祛瘀之功。全方以通調肺氣為核心,宣發以使“天氣通于肺”,肅降以使“地氣納于腎”,充分體現了宣降肺氣、通調水道,祛痰逐瘀的功效,切中病機,恢復肺之宣降功能。
   
  本實驗的結果顯示,三拗芎葶合劑能夠有效改善模型大鼠的呼吸、活動、飲食、體重等整體情況;能明顯降低模型大鼠的肺動脈高壓,在一定程度上改善肺功能;提高SOD活性水平,降低MDA含量,其機理可能與清除自由基、抗脂質過氧化,保護EC;維持VSMC的正常舒張功能,部分逆轉肺血管結構重建。   
   
  缺氧時肺血管內氧自由基產生增加,氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸而引發脂質過氧化作用,并因此形成脂質過氧化物如MDA。MDA能損傷細胞膜,抑制Na+-K+-ATP酶,使Ca2+細胞內流增加,導致細胞內Ca2+超負荷,既可使支氣管黏膜上皮細胞壞死,又可致肺血管及支氣管平滑肌痙攣[5]。MDA是氧自由基導致的脂質過氧化代謝的最終產物,而SOD則是氧自由基的有效清除劑。此外,SOD是細胞保護因子。氧自由基在體內不斷地產生和清除,在病理情況下,氧自由基產生增多,它與生物膜作用,使脂質過氧化物的產生增多,導致對血管內皮的損傷,增加肺血管的阻力,增強肺動脈的收縮反應[6],引起肺動脈高壓,說明氧自由基在肺動脈高壓形成中起一定的作用。
   
  本實驗研究發現,慢性低氧大鼠肺組織中MDA含量明顯升高,SOD活性明顯降低,而三拗芎葶合劑和卡托普利治療組肺組織中MDA含量明顯降低,SOD活性明顯增強。因此認為, 三拗芎葶合劑可降低氧自由基的產生,并有較強的清除氧自由基的作用,增加細胞對缺氧的耐受性,限制了氧自由基對肺動脈內皮細胞及平滑肌細胞的損傷,阻抑肺血管收縮及肺血管結構重建。故認為三拗芎葶合劑對臨床上由COPD等引起的肺動脈高壓有較好的預防及治療作用。三拗芎葶合劑還能部分逆轉模型大鼠的右心室肥厚,其機制與改善肺血流動力學狀態,以減低右心室的后負荷,改善右心功能有關。
   
  綜上所述,本研究采用改良右心導管法,直觀而準確地反映了三拗芎葶合劑對大鼠實驗性肺心病形成過程中低氧性肺動脈高壓的防治作用,為中藥防治低氧性肺動脈高壓提供了一定的理論和實驗依據。

【參考文獻】
    1 蔣明,鐘小寧,柳廣南,等.慢性支氣管炎、肺氣腫并肺動脈高壓動物模型的研制.中國呼吸與危重監護雜志,2006,5(4):287-291.

  2 奚肇慶,蔣萌,居文政,等.復方薤白膠囊治療慢性阻塞性肺病36例臨床與實驗研究. 中醫雜志,2000,4(41):218-220.

  3 肖詩亮,高思海,楊辰垣. 常壓缺氧性大鼠肺動脈高壓模型的改進. 技術與方法,2001,17(4):190.

  4 郭勝祥,牛淑潔,翁心植,等. 一種簡易實用的常壓低氧艙系統. 中華結核和呼吸雜志,1996,19(4):252.

  5 馮青. 哮喘患者血清超氧化物歧化酶、丙二醛檢測結果分析. 廣西醫科大學學報,1997,14(3):66-67.

  6 湯湘江,何德平,林琳.補氣活血中藥對肺原性心臟病的血液粘度、氧自由基和血漿NO的影響. 廣州中醫藥大學學報,1999,12(6):289.


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