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血清鐵調素在骨質疏松模型中變化趨勢的觀察*

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:馬勇 2008-7-4

摘要: 【摘要】 目的 研究SD大鼠維甲酸灌胃骨質疏松模型中血清hepcidin含量的變化。方法 取72只大鼠分為模型組和對照組,模型組以維甲酸70mg/(kg·d)持續灌胃14天,對照組等量蒸餾水灌胃14天,雙能X線骨密度儀器進行活體骨密度測定,模型組和對照組血清hepcidin含量ELISA試劑盒進行測定。結果 骨密度的測定顯示骨質疏......


【摘要】  目的 研究SD大鼠維甲酸灌胃骨質疏松模型中血清hepcidin含量的變化。方法 取72只大鼠分為模型組和對照組,模型組以維甲酸70mg/(kg·d)持續灌胃14天,對照組等量蒸餾水灌胃14天,雙能X線骨密度儀器進行活體骨密度測定,模型組和對照組血清hepcidin含量ELISA試劑盒進行測定。結果 骨密度的測定顯示骨質疏松模型組骨密度較對照組降低,差異有顯著性。模型組和對照組相比較,血清hepcidin含量在模型建立過程中有變化:初期略有降低,差異無顯著性;中期明顯降低,差異有顯著性;后期略有回升,低于對照組,差異無顯著性。結論 血清hepcidin含量變化與維甲酸致骨質疏松形成可能存在直接或間接關系,hepcidin的變化可能成為骨質礦化異常診斷、治療的新焦點,為進一步研究骨質疏松提供新的思路。

【關鍵詞】  骨質疏松 維甲酸 鐵調素 血清

    Observation of changes of serous hepcidin concentration in SD rats osteoporosis model   

    MA Yong, XU You-jia, QIAN Zhong-ming, et al.  Department of Orthopaedics, The Second Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China

    【Abstract】  Objective  To investigate the changes of serum hepcidin concentration in SD rats osteoporosis model induced by intragastic administration with tretinoin.  Methods  72 SD rats were divided into experimental group and control group randomly, treated the experimental group with tretinoin and the control group with distilled water of equal quantity by intragastic administation for lasted 14 days, assayed the bone density with dual energy X-ray absorptiometry (DEXA) and serum hepcidin concentration of experimental group and control group with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results  The assay of bone density indicated that bone density of experimental group was much lower than control group. In contrast to control group, serum hepcidin concentration of experimental group changed in the formation process of osteoporosis model. The serum hepcidin concentration decreased slightly with no significant difference at early stage, decreased obviously with significant difference at intermediate stage. But increased slightly at late stage, still lower than concentration of serum hepcidin of control group, decrease was of no statistics meaning. Conclusion  The changes of serum hepcidin concentration may have direct or indirect relation with osteoporosis formation induced by intragastic administration with tretinoin. Perhaps hepcidin investigation will become a new focus point in diagnosis and treatment of bone mineralization abnormality and make great progress in studying osteoporosis.

    【Key words】  osteoporosis;tretinoin;hepcidin;serum

    近幾年來,許多研究結果認為體內鐵代謝平衡和紊亂與骨質礦化有著密切的聯系。在研究絕經女性骨質疏松治療、預防時發現鐵的攝入與骨的礦化密度呈正相關[1,2]。Denis M. Medeiros等研究發現鐵缺乏飲食的骨礦化不良[3]。Margaret M. Harris等[4]研究結果顯示絕經后婦女的飲食鐵攝入增加可以提高骨密度。

    鐵調素(hepcidin)是一種富含半胱氨酸的抗菌多肽,2001年Park等[5]首次從人尿中分離到這一多肽,并將其命名為鐵調素。這種循環抗菌肽物質,在鐵的動態平衡中發揮有效作用,作為激素樣物質調節鐵旁路途徑的吸收、利用、貯存和再利用(肝臟和巨噬細胞) [6,7]。本實驗將兩者結合起來,以骨質疏松為研究平臺,旨在了解本實驗研究模型基礎上血清hepcidin 在“骨質疏松”形成中的變化情況。

    1  資料與方法

    1.1  實驗動物  由蘇州大學醫學院動物實驗中心提供。純系SD雄性大鼠,72只,3月齡,體重(220±20)g;實驗分組:模型組45只,對照組27只。

    1.2  模型制作  大鼠飼養條件相同,喂以大鼠標準飼料和水。模型組鼠:蒸餾水溶解的維甲酸懸液,濃度7mg/ ml,以70mg/kg灌胃,每天1次,連續14天;對照組鼠:等量蒸餾水灌胃,連續14天。

    1.2.1  實驗處理  在灌胃處理后模型組鼠第1、3、5、7、8、9、11、12、14天處死(每次5只)和對照組鼠分別于相對應天處死(每次3只)。研究選擇時間點是根據已有的初步研究結果[8]。

    1.2.2  處死方法  采用3.6%水合氯醛腹腔麻醉,心臟取血,血清-20℃條件下保存,用于ELISA檢測。

    1.3  大鼠活體骨密度測定  儀器:骨密度測定DXA骨密度儀,Lunar公司,小動物掃描軟件;條件設定為:步距0.5 mm ×0.5 mm ,掃描速度10mm/ s ,通過雙能X射線骨密度測定儀測定正常對照組和模型組的骨密度,分析股骨、脛骨、腰椎骨選取感興趣區域骨密度值。

    1.4  血清hepcidin測定方法  按照ELISA試劑盒操作,試劑盒:Hepcidin Prohormone ELISA,96 well, DRG instruments GmbH, Germany(r=0.997)。

    1.5  統計學處理  應用SPSS11.0統計軟件,所有數據用均數加減標準差(x±s)表示,兩組間進行t檢驗,P<0.05差異顯著性。

    2  結果

    2.1  骨密度  灌胃前后,對照組、模型組活體大鼠椎體、脛骨干和股骨干、股骨髁骨密度,模型組骨密度值明顯降低(見表1)。表1  模型組、對照組各部位實驗前后骨密度

    2.2  血清鐵調素含量  模型組和對照組比較,模型組的hepcidin含量第3、5、7、8、9、11、12天低于對照組,差異有顯著性;而第1天和第14天含量也較對照組低,但沒有明顯差異;對照組hepcidin選取天的含量變化無明顯差異性(見圖1、表2)。圖1  模型組和對照組血清hepcidin含量表2  模型組和對照組血清hepcidin含量 

    對照組hepcidin選取天的含量變化無明顯差異性,呈現水平波動改變;和對照組比較,模型的hepcidin含量第1、3、5、7、8、9、11、12、14天都低于對照組,整體呈現初期降低,中期最低,后期略回升改變。

    3  討論

    骨質疏松動物模型主要有維甲酸灌胃法、去勢法和糖皮質激素注射法三種造模方式,其中維甲酸誘導觀察周期穩定、成功率高和骨質疏松表現典型,本研究選用維甲酸灌胃法制作模型[9] 。本研究骨密度測定結果顯示模型組的骨密度較對照組明顯降低,差異有顯著性,證實了模型建立成功,與以往的研究符合。

    體內鐵貯存、鐵代謝與骨質礦化和Ca2+有著密切的聯系,一系列的研究表明鐵動態平衡變化將影響骨代謝。Spanner 等人的研究結果認為鐵蛋白(維持鐵生物利用度的金屬結合蛋白)在體和體外成骨細胞系的細胞上表達,調節著骨細胞胞內鐵的轉運,從而影響骨內金屬離子的動態平衡[10]。2003年Ci等[11]研究顯示,在K562細胞中,細胞鐵攝入很大程度受到胞內鈣離子濃度的調節,胞內游離鈣離子升高會加速鐵攝入的初始效率、全面提高細胞鐵攝入能力。因此,鐵代謝與Ca2+變化的關系,不僅越來越相關,而且越來越明確。

    另一方面,關于鐵代謝調節在2000年有了突破性進展。2000 年,Krause 等[12]首先從人血液中分離純化了這一多肽,稱之為肝臟表達的抗菌多肽(liver-expressed antimicrobial peptide ,L EAP-1),2001 年Park 等[5]從人尿中分離到這一多肽,并將其命名為hepcidin。Hepcidin這種多肽調節鐵吸收、利用、貯存和再利用(肝臟和巨噬細胞)[6,7]。Fleming、Chang等分別在2001、2002、2003年發表文章,認為鐵代謝中影響骨細胞對鈣吸收的重要分子可能是hepcidin(鐵調素)[6,13,14]。Nicolas 等[15]證實鐵沉積的發生與USF2無關,是hepcidin 缺乏導致小鼠進行性組織鐵積聚,而且發現hepcidin 高表達的轉基因鼠出現嚴重的鐵缺乏,呈現嚴重的小細胞性貧血且生存時間大為縮短。Pigeon 等[16]證實,飲食鐵含量增高或者肝鐵增加均可導致肝臟hepcidin 表達增加。所有這些結果均證實hepcidin 在機體鐵代謝調節中具有重要作用。

    本研究顯示:大鼠骨質疏松模型組,血清hepcidin含量在模型建立過程的第3、5、7、8、9、11、12天含量顯著降低,而對照組沒有這樣的改變趨勢。動物實驗出現hepcidin含量降低變化,可能的解釋:(1)在骨質疏松形成過程中,hepcidin體內存在變化,而已有研究說明,鐵調素變化與鐵代謝有關,鐵代謝與鈣代謝有關,本研究符合這一觀點。(2)由于是在骨質疏松模型形成的中期,鐵調素改變,這就有兩種假設。 ①骨質疏松模型的誘因(維甲酸)刺激體內鐵調素變化,而鐵調素變化影響鐵變化,鐵變化又影響鈣變化;②骨質疏松形成中,鈣變化影響鐵的變化,鐵變化又引起鐵調素變化。(3)由于影響血清hepcidin變化的因素也有可能在骨質疏松形成中出現變化,故其他因素變化(炎癥因子等)也可而引起hepcidin的變化。(4)由于維甲酸作為一種白血病治療的誘導藥物,對血液各系細胞有影響,而血液各系細胞的變化可能引起hepcidin的變化。總之,本研究認為在骨質疏松形成諸多因素中,鐵調素是一個參與因素。

    本研究的結果為干預鐵調素影響骨代謝平衡提出了新的研究平臺,為進一步研究骨質疏松提供新的思路。隨著鐵調素已開始進行人工合成研究,已有學者正致力于將鐵調素商品化。在骨質疏松研究領域,觀察、研究“鐵代謝調節因素(鐵調素)”在“骨代謝異常(骨質疏松)”過程中的作用,對于骨質疏松癥的機理、治療、轉歸評定將有著十分積極的臨床意義。所以,及早、全面了解鐵調素對骨組織代謝異常的影響,將對骨質疏松診斷、治療等方面提供新的干預方法研究有著十分重要的現實意義。

【參考文獻】
  1 Isomura H, Fujie K, Shibata K, et al. Bone metabolism and oxidative stress in postmenopausal rats with iron overload. Toxicology, 2004,197:93-100.

2 Maurer J, Harris MM, Stanford VA, et al. Dietary iron positively influences bone mineral density in postmenopausal women on hormone replacement therapy. Journal of Nutrition, 2005,135:863-869.

3 Denis M. Medeiros, Aaron Plattner, Dianne Jennings, et al. Bone Morphology, Strength and Density Are Compromised in Iron-Deficient Rats and Exacerbated by Calcium Restriction. J Nutr,2002, 132:3135-3141.

4 Margaret M. Harris, Linda B. Houtkooper, Vanessa A. Stanford, et al. Dietary Iron Is Associated with Bone Mineral Density in Healthy Postmenopausal Women. Nutr,2003,133:3598-3602.

5 Park CH, Valore EV, Waring AJ, et al. Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver. Journal of Biological Chemistry,2001,276: 7806-7810.

6 Fleming RE, Sly WS. Hepcidin: a putative iron-regulatory hormone relevant to hereditary hemochromatosis and the anemia of chronic disease. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98:8160-8162.

7 Fleming RE, Sly WS. Mechanisms of iron accumulation in hereditary hemochromatosis. Annu Rev Physiol, 2002,64:663-680.

8 馬勇,徐又佳,王愛東,等.大鼠骨質疏松模型中肝臟hepcidin基因表達的初步報告.蘇州大學學報(醫學版),2006,26(3):367-369.

9 吳波,徐冰,黃添友,等. 維甲酸致大鼠骨質疏松模型與機理研究. 藥學學報,1996,31 :241-245.

10 Spanner M, Weberk, Lanske B, et al. The iron-binding protein ferritin is expressed in cells of the osteoblastic lineage in vitro and in vivo. Bone,1995,17:161-165.

11 Ci W, Li W, Ke Y, et al. Intracellular Ca2+ regulates the cellular iron uptake in K562 cell. Cell Calcium, 2003,33:257-266.

12 Krause A , Neitz S , Magert HJ , et al. L EAP21 , a novel highly disulfide-bonded human peptide , exhibits antimicrobial activity. FEBS Lett, 2000,480 :147-150.

13 Chang YZ, Yuan QP, Zhou B, et al. Hepcidin and iron homeostasis. Chin J Endocrinol Metabol,2003,19:501-504.

14 Chang YZ, Duan SL, Qian ZM. Transferrin receptor-2:current knowledge. Prog Biophy Biochem,2003,30:533-536.

15 Nicolas G, Bennoun M , Porteu A , et al. Severe iron deficiency anemia in transgenic mice expressing liver hepcidin. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99 :4596-4601.

16 Pigeon C , Ilyin G, Courselaud B , et al. A new mouse liver-specific gene , encoding a protein homologous to human antimicrobial peptide hepcidin, is overexpressed during iron overload. J Biol Chem, 2001,276 :7811-7819.


作者單位:215004 江蘇蘇州,蘇州大學附屬第二醫院(Δ通訊作者)


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