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節律化療聯合最大耐受劑量化療抗腫瘤作用的實驗研究*

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:高會霞 2008-7-4

摘要: 【摘要】 目的 探討環磷酰胺(CTX)節律化療聯合最大耐受量(MTD)化療對小鼠Lewis肺癌(LLC)腫瘤生長、血管生成和遠處轉移的影響。方法 荷瘤小鼠隨機分4組:分別為(1)CTX節律化療組。(3)聯合組(CTX節律化療聯合MTD化療)。觀察各組腫瘤生長及肺轉移情況,檢測小鼠腫瘤組織和肺組織中CD34、基質金屬蛋白酶-9(......


【摘要】  目的 探討環磷酰胺(CTX)節律化療聯合最大耐受量(MTD)化療對小鼠Lewis肺癌(LLC)腫瘤生長、血管生成和遠處轉移的影響。方法 荷瘤小鼠隨機分4組:分別為(1)CTX節律化療組;(2)MTD組;(3)聯合組(CTX節律化療聯合MTD化療);(4)對照組。觀察各組腫瘤生長及肺轉移情況,檢測小鼠腫瘤組織和肺組織中CD34、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和趨化因子受體-4(CXCR4)蛋白的表達。結果 CTX節律化療聯合MTD化療對小鼠LLC的腫瘤生長、血管生成和遠處轉移均有顯著的抑制作用。聯合組和節律組的微血管密度(MVD)、肺轉移率、MMP-9和CXCR4蛋白的表達明顯低于對照組和MTD組 (P<0.05)。結論 在MTD化療的基礎上聯合節律化療可明顯抑制LLC的腫瘤生長、血管生成和遠處轉移。節律化療有可能通過下調瘤組織中MMP-9和CXCR4蛋白的表達而發揮作用。

【關鍵詞】  節律化療 環磷酰胺 血管生成 基質金屬蛋白酶-9 趨化因子受體-4 


    Experimental research on the antitumor effect of the metronomic combined with maximum tolerated dose chemotherapy

    GAO Hui-xia,ZHOU Xi-shan,YAO Xiao-jian,et al.The First Affiliated Hospital of Zheng zhou University,Zhengzhou 450052,China

    【Abstract】  Objective  To detect the effect of cyclophosphamide(CTX) administered by means of metronomic chemotherapy combined  maximum tolerated dose (MTD) chemotherapy on the angiogenesis, carcinogenesis and metastasis of Lewis lung cancer(LLC) on C57BL/6 mouse model. Method  The mice were randomly divided into four groups:(1)metronomic chemotherapy group,(2)MTD group,(3)combination group(metronomic chemotherapy combined MTD group),(4)control group. Tried to deserve the tumor growth and lung metastasis of every group and detect the expression of CD34, MMP-9 and CXCR4 in tumor tissue and lung. Results  CTX administered by metronomic chemotherapy combined with MTD inhibited significantly tumor growth, angiogenesis and metastasis of LLC. The MVD, lung metastasis rate, expression of MMP-9 and CXCR4 of combination group and metronomic group were much lower than control group and MTD group (P<0.05). Conclusion  Based on MTD chemotherapy, CTX administered by concurrent metronomic chemotherapy, appears to inhibit significantly tumor growth, angiogenesis and metastasis of LLC. Potentially, by means of down regulating the expression of MMP-9, and CXCR4 in tumor tissue, metronomic chemotherapy performs.

    【Key words】   metronomic chemotherapy; cyclophosphamide(CTX); angiogenesis; matrix metalloproteinase-9(MMP-9); chemokine receptor-4(CXCR4)

    近年來發現低劑量、高頻度的節律化療對腫瘤血管內皮細胞及其前體細胞具有破壞作用而表現出極好的抗血管生成作用。在我們以前的實驗中,發現環磷酰胺(CTX)最大耐受量(MTD)化療對小鼠Lewis肺癌的生長抑制作用優于節律化療,而節律化療的不良反應輕且有明顯的抗血管生成作用。據此推測如果把節律化療聯合MTD化療有可能會進一步提高療效。本報告研究了聯合兩種用藥方法對腫瘤的抑制作用,同時探索節律化療的轉移抑制作用。

    1  材料與方法

    1.1  材料  瘤株:Lewis肺癌細胞株(LLC),由上海市肺科醫院肺癌免疫研究室惠贈。試劑:CTX粉針劑(0.2g/瓶);CD34一抗, CXCR4一抗, SABC免疫組化染色試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司; MMP-9一抗,Santa公司; SP-9003免疫組化染色試劑盒,Zymed公司。動物:C57BL/6純系小鼠,雌性,6~8周齡,體重18~22g,河南省實驗動物中心提供。

    1.2  荷瘤動物模型的建立  將傳代2周的荷瘤鼠斷頸處死,無菌條件下剝出瘤塊制成腫瘤細胞懸液,每只C57BL/6小鼠右腋部皮下接種0.2ml(含瘤細胞數2×106個)。

    1.3  實驗流程  分組和用藥:隨機將荷瘤鼠分4組:(1)CTX節律化療組:腹腔注射CTX 35mg/kg,隔天1次;(2)MTD組:腹腔注射CTX 150mg/kg,隔天1次,共3次,21天1周期;(3)聯合組:腹腔注射CTX 150mg/kg,隔天1次,給藥3次后休息5天,從第11天開始CTX 35mg/kg,隔天1次,共5次;(4)對照組:腹腔注射生理鹽水0.2ml,隔天1次。每組10只小鼠。以上各組均于腫瘤接種后第9天(瘤體400~700mm3)起連續給藥20天。

    從接種后第9天開始,隔日測量瘤塊最長徑(a)和與其垂直的短徑(b),按照公式V(mm3)=ab2/2計算瘤體積,繪制腫瘤生長曲線。從第9天開始,隔日稱小鼠體重。第30天,處死小鼠剝離瘤體并稱重。用免疫組化法染色計數腫瘤組織和肺組織內微血管密度(MVD)、MMP-9和CXCR4表達情況。

    1.4  結果判定  MVD判定標準:低倍鏡下找血管密度最高區, 5個高倍鏡視野下計數被染色血管的平均數目。任何被CD34抗體染成棕黃色的單個細胞或細胞團,不管是否形成管腔,只要與周圍組織有清楚的分隔都可計數,血細胞和大的血管腔不計。MMP-9判斷標準:胞漿或胞膜出現棕黃色或黃色為陽性細胞,表達強度由染色細胞數和染色深度共同評分。陽性細胞染色深度按無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別打0、1、2、3分,陽性著色面積按無著色、著色<1/3、著色1/3~2/3、著色>2/3分別打0、1、2、3分。兩積分之和由高到低分4級,6分( + + + ),4~5分( + + ),2~3分( + ),0~1分( - )。CXCR4判斷標準:陽性細胞百分率:≤5%、6%~25%、26%~50%、51%~75%、≥76%分別為0、1、2、3、4分;著色強度:無著色、淡黃色、黃色、棕黃色分別為0、1、2、3分,兩者積分乘積:0陰性( - ) , 1~2弱陽性( + ) ,3~4陽性( + + ),≥5強陽性( + + + )。[注:(-)、(+)為低表達組,(++)、(+++)為高表達組]。

    1.5  統計學處理  統計學方法應用SPSS12.0統計軟件。采用方差分析和χ2 檢驗

    2  結果

    2.1  各組小鼠體重變化,處死后瘤重  對照組小鼠體重增長較快, CTX節律化療組增長緩慢, MTD組先下降后快速增長,聯合組先下降后緩慢增長。處死后各組小鼠平均瘤重:對照組(13.52±1.26)g,節律化療組(6.57±0.72)g, MTD組(4.65±0.43)g,聯合組(2.03±0.34)g。節律化療組、MTD組、聯合組與對照組相比差異有顯著性(P<0.01)。

    2.2  各組小鼠腫瘤生長情況  對照組小鼠腫瘤生長迅速,生長曲線陡直, CTX節律組生長曲線較平緩, MTD組腫瘤先縮小后迅速生長,聯合組腫瘤先縮小后緩慢生長,生長曲線如圖1所示。

    2.3  剝出腫瘤的大體情況  對照組剝出腫瘤時出血較多,均見腫瘤侵犯胸壁及皮膚,腫瘤切面壞死少腫瘤生長比較活躍。MTD組8只侵犯胸壁,均侵犯皮膚,出血較多。聯合組和節律組腫瘤包膜較完整。節律組腫瘤稍大,均見皮膚侵犯,聯合組腫瘤小有6只見侵犯皮膚,聯合組和節律組腫瘤均未侵犯胸壁,兩組腫瘤切面壞死較多,出血較少。圖1  腫瘤生長曲線2.4  各組小鼠肺轉移情況  在剝出小鼠肺時可見對照組和MTD組有明顯的肺轉移現象,而節律組和聯合組沒有,差異有顯著性(P<0.05),見表1。表1  各實驗組小鼠肺轉移情況

    2.5  各實驗組免疫組化微血管計數   節律化療組和聯合組腫瘤組織內MVD明顯低于對照組和MTD組,差異有顯著性(P<0.01),見表2。表2  各組腫瘤組織中微血管計數比較

    2.6  各實驗組MMP-9、CXCR4表達情況  節律組和聯合組瘤組織和肺組織內MMP-9、 CXCR4的強陽性表達率低于對照組和MTD組,差異有顯著性(P<0.05),見表3。表3  各組腫瘤組織中MMP-9、 CXCR4表達比較

    3  討論

    近年研究發現高頻率、低劑量、低毒性的節律化療有明顯的抗血管生成作用。我們以前的研究也證實了CTX節律化療抗血管生成作用明顯,但其早期的腫瘤抑制作用不如MTD化療[1]。雖然MTD化療也能殺傷腫瘤間質中的血管內皮細胞,但MTD化療毒性大,需要較長的恢復期,在恢復期后期血管內皮細胞得以修復,腫瘤又迅速生長。因此本研究將CTX節律化療與MTD化療聯合以期達到更好的治療效果。

    本研究結果發現,在MTD化療的間歇期后期增加節律化療能明顯抑制腫瘤的生長。光鏡下可以看到,聯合化療組和節律組腫瘤組織內MVD明顯低于MTD組和對照組,再次證實了抗血管生成作用。更重要的是在我們的研究中發現,聯合組和節律化療組的肺轉移率明顯低于MTD組和對照組,免疫組化結果顯示聯合組和節律化療組腫瘤組織和肺組織內CXCR4和MMP-9的表達明顯降低。因此認為,CTX節律化療除有抗血管生成作用外,還有明顯的抗腫瘤轉移作用。

    趨化因子受體-4(CXCR4)為一種G蛋白耦聯受體,CXCL12是目前已知唯一與CXCR4結合并激活的天然趨化因子。Phillips 等[2]證實CXCL12-CXCR4 生物學軸在非小細胞性肺癌的器官特異性轉移中發揮重要作用。炎癥細胞因子,如IL-1、TNF、IL-8是NF-κB的潛在誘導劑,而NF-κB則是CXCR4的潛在誘導劑[3]。而且在我們以前的研究中發現節律化療能明顯的抑制小鼠腫瘤組織中NF-κB的表達[4]。MMP-9是MMPs家族中的重要成員,能降解破壞ECM和BM,與腫瘤的浸潤轉移密切相關[5],而且有研究報道CXCL12 作用于CXCR4促進腫瘤分泌MMP-9[6]。由我們的研究結果推測,CTX節律化療可能是直接抑制了腫瘤組織和肺組織內CXCR4和MMP-9蛋白的表達,從而抑制了基底膜的降解,減少了腫瘤細胞的遷移,同時破毀了腫瘤賴以生存的環境,使轉移至靶器官的腫瘤細胞難以存活而抑制了轉移;或者是抑制了NF-κB的表達并通過NF-κB、CXCR4和MMP-9之間的相互作用而間接的發揮作用。

    雖然我們的研究結果還不能闡明節律化療抗轉移的作用機制,但是它進一步豐富和拓展了節律化療的作用機制。為抗轉移治療提供了一定的研究基礎,為臨床手術或放療后的腫瘤病人應用節律化療預防轉移提供了實驗室依據。

 

【參考文獻】
  1 王云,梁憲斌,紀媛媛,等. 環磷酰胺節律化療的抗血管生成作用探討.山東醫藥,2005,46(6):17-19.

2 Schioppa T,Uranchimeg B,Saccani A,et al.Regulation of the chemok- ine receptor CXCR4 by hypoxia. J Exp Med, 2003, 198(9) :1391-1402.

3 Kato M,Kitayama J,Kazama S,et al.Expression pattern of CXC chemokine receptor-4 is correlated witth lymph node metastasis in human invasive ductal carcinoma.Breast Cancer Res,2003,5(5):144-150.

4 韓穎,周芳,蔡政,等.紫杉醇節律化療抗Lewis肺癌血管生成作用的實驗研究.腫瘤基礎與臨床,2007,20(4):277-279.

5 Okada A.Roles of metalloproteinases and tissue inhibitor of metall- oproteinase(TIMP)in cancer invasion and metastasis.Gan To Kagaku Ryoho,1999,26(14):2247-2252.

6 Kang H,Mansel R,Jiang W.Genetic manipulation of stromal cell- deri- ved factor-1 attests the pivotal role of the autocrine SDF- 1- CXCR4 pathway in the aggressiveness of breast cancer cells. Int J Oncol, 2005,26: 1429-1434.


作者單位:450052 河南鄭州,鄭州大學第一附屬醫院(Δ通訊作者)


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